在差异表达，其中46个基因在肿瘤相关上皮中特异地性表达，包括至少7个基因编码细胞外基质形成和重塑蛋白。这些肿瘤上皮标志物大多表达在众多肿瘤类型中，同时也在正常组织创伤愈合、黄体形成(co rp u s lu teum fo r m ati on)时存在。
3.2.4用于酵母研究 V elcu lescu等[2]用SA GE方法分析了酵母基因组基因，得到代表4665个基因的60633个转录本，表达水平分布在每个细胞0.3到200多个转录本，在这些基因中,1981个为已知功能的基因,2684个为先前未定性的基因，将基因定位在染色体上后，位置信息与基因表达数据相结合，以染色体长度为横轴，转录标签丰度为纵轴，绘制染色体表达谱，可以识别以前单纯靠序列信息所不能预测的基因。
3.2.5用于植物研究 M atsum u ra等[19]研究了水稻幼苗的10122个标签，这些标签代表了5921个不同基因转录子，其中只有23.1%即1367个基因与DNA数据库已知c DNA序列匹配。他们发现水稻幼苗中高表达的基因中大部分属于看家基因：即编码核糖体蛋白和负责新陈代谢和细胞结构的蛋白的基因，还发现表达最高的基因是一种金属硫蛋白基因，共占到全部基因表达的2.7%，第一次定量研究了高等植物全部基因表达。
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(2001205228 收稿)
c DNA末端快速扩增技术新进展
钟 涛综述 吴瑞英审阅
浙江大学医学院微波研究室(杭州,310031)
摘要 全长c DNA的获得是基因克隆的重要内容，也是目前人类基因组研究中的一个重要方面。c DNA末端快速扩增(RA CE)技术是以PCR为基础，从部分已知的c DNA序列扩增出其他未知部分的5′端和3′端的c DNA 序列的一种方法。本文从RA CE技术的基本原理方法出发，详细阐述了其存在的缺陷，并对RA CE最新研究进展，如M arathon2PCR、Sm art2RA CE以及“电子”c DNA克隆等作一综述。
关键词 c DNA; c DNA末端快速扩增; 基因克隆
c DNA末端快速扩增(rap i
d am p lificati on of c DNA ends,RA CE)技术是基于PCR技术由已知的部分c DNA序列来获得完整c DNA序列的一种方法，为F rohm an[1]在1985年首次报道，近年来围绕着减少非特异性扩增产物或截短的产物背景、改进3个连续的酶促反应步骤(逆转录、T dT加尾、PCR扩增)等，先后发展出LA2PCR(ligati on an2 cho red PCR)、SL I C2PCR(single2strand ligati on to single2stranded c DNA ends PCR)、RLM2RA CE (RNA liga2m ediated RA CE)、RL2PCR(revers
e ligati on2m ediated PCR)、M arathon2RA CE、Sm art2 RA CE(s w itch ing m echan is m at5′2end o
f RNA tran scri p t RA CE)和RA CE与生物信息学结合的所谓“电子”c DNA克隆等。本文即从RA CE技术的基本原理和特点出发，包括其方法学的改进，和最新的进展作一较为详细综述。
1 RACE 的基本原理、方法和特点
111 原理和方法
RA CE 技术是以分子生物学上应用最广泛的聚合酶链反应(PCR )技术为基础，从部分已知的
c DNA 序列扩增出其他未知部分的5′
端和3′端的c DNA 序列，因此该方法也被称为锚定PCR (an 2cho red PCR )
[2]
和单边PCR (one 2side PCR )[3]。
RA CE 的引物设计包括锚定引物和基因特异引物(图1A )。在3′RA CE 中,Q 0、Q 1、Q T 为3个锚定引物;Q 1引物含有编码H ind 、Sst 、
及Xho 的识别位点;Q 0与Q 1通过一个核苷酸重叠，两者组合后再加上17个o ligo 2(dT )序列就构成了Q T 引
物(5′2Q 02Q 12T T T T 23′)(图1A );GSP 1、GSP 2为
两个基因特异引物，是根据已知的c DNA 部分序列设计而成。3′RA CE 的过程如下(图1B )，以Q T 逆转录总RNA 得到第一条c DNA ；再用Q 0与GSP 1以第一条c DNA 为模板进行第一轮PCR 扩增，得到双链c DNA ，最后用“嵌套”引物(Q 1与GSP 2)进行第二轮PCR 扩增，防止产生非特异性扩增产物。
5′RA CE 与3′RA CE 略有不同(图1C )，首先
引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP 2R T ；其次在酶促反应中，增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP 2R T 逆转录m RNA 得到第一条c DNA 后，用脱氧核糖核酸末端转移酶(T dT )和
dA T P 在c DNA 5′
端加po ly (A )尾，再用Q T 引物合成c DNA 第二条链。余同3′RA CE 过程，用Q 0与
GSP 1(GSP 2R T 上游引物)扩增c DNA ，最后用
“嵌套”引物(Q 1与GSP 2)进行第二轮PCR 扩增，以提高特异性。
3′RA CE 与5′RA CE 扩增得到的双链c DNA
用限制性内切酶酶切，再以Sou thern 印迹分析检测酶切后的DNA 片段中是否存在与已知c DNA 部分
序列制作的探针同源的序列。对同源序列进行克隆，即得到5′和3′特异性的c DNA 产物。最后从两个有相互重叠序列的3′和5′RA CE 产物可获得全长c D 2
NA ；或者通过分析RA CE 产物的3′
和5′末端序列，再合成相应的引物，扩增出全长c DNA 。112 RACE 特点
RA CE 法廉价、操作快速。用RA CE 获得c D 2NA 克隆只需要几天的时间，且只需极少量的起始
反应物质，并能迅速反馈是否有目的产物生成，因此，根据不同情况修改RNA 制备程序和修改反转录条件，直至获得和观察到全长c DNA ，是可行的。
RA CE 法能够获得可能的5′
端调控序列和多图1 RA CE 原理和方法
暮光之城男主角聚腺苷化信号序列的信息，有助于选择引物以用于
在线翻译网(如在可能的剪接外显子内)从转录模型非常复杂的基因中扩增c DNA 的亚群；而且不同的剪接或起始转录物可分别用电泳分离和克隆。
RA CE 能产生大量独立克隆，这些独立的克隆可用来证实核苷酸序列，并使得被选择性剪接或开始于很少使用的启动子的特殊转录物的分离成为可能。考研专业课真题下载
对于5′末端扩增，由于产生了引物延伸文库代替一般的目的文库，因此会使反转录酶延伸c DNA 到m RNA 末端所有通路的能力大大增加。
2 RACE 的缺陷与改良
利用RA CE 技术来扩增未知c DNA 序列相对
c DNA 序列文库筛选方法是很有价值的，但有一些报道也认为要成功运用这种方法还有许多技术上的困难[4～8]。一般来说，有两个原因导致较高的失败率，一是在3个连续的酶促反应步骤中(逆转录、T dT 加尾、PCR 扩增)，每一个步骤的失败都会导致实验部分或完全失败；二是即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。这些步骤中可能出现的问题以及相应的改良方法以下分别详述。
吉胡阿依211 反转录
影响RA CE实验结果最关键的步骤是m RNA 反转录合成完整的第一条c DNA链，对想获得全长5′端尤为重要，这是因为非全长c DNA分子有着与全长分子一样的末端(例如，在c DNA引物内有着同样的特
异3′端序列,5′端有着同样的锚定序列)，这样在有相同末端的不同种类的PCR混合产物中，非全长的DNA分子就会优先扩增[9]，而使得能代表全长c DNA的PCR产物大大减少甚或消除。在反转录步骤中，为尽量避免产生非全长的c DNA，首先得有高质量的不被核糖核酸酶降解的m RNA，如使用多聚腺苷酸m RNA，可以防止含有内含子的c DNA产生和克隆。若有足量的m RNA，在做RA CE前应先电泳，做N o rthern杂交以确定目的m RNA确实存在并且没有被降解[9]。
212 TdT加尾反应及其替代反应
5′RA CE过程中应用T dT酶加上多聚A尾有很大的局限性，常会失败或出现一些副产品。首先在反转录后，一些无用的核苷酸和过多的c DNA引物的存在会干涉加尾的成功，降低目的c DNA加尾的有效性，从而导致第二链c DNA合成效率的降低[10]。其次,T dT反应难以控制，所有的c DNA都被加尾，而不管是否是全长c DNA，这样产生的非全长的c DNA将和全长产物一起完成PCR反应[11]，而且会优先扩增，不能保证在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。第三，若目的c DNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区，则在合成第二条c DNA链时引物的延伸会从内部序列而不是终末序列开始，产生非全长的第二条c DNA链[9]。鉴于此，几个研究小组分别独立地围绕T dT加尾反应对RA CE作了很多改进，重点是1991年Edw ards[4]小组的SL I C2PCR(single2strand ligati on to ss2c DNA ends PCR),T rou tt[5]小组的LA2PCR(ligati on an2 cho red PCR)。B ertling[12]等提出的依赖于DNA连接酶的扩增(DNA liga2dependen t am p lificati on, DLDA),L iu等的RNA连接酶介导的RA CE (RLM2RA
great怎么读
CE)[6]或反向连接介导PCR(RL2 PCR)[13]，以及M aruyam a及Sugano创造了o ligo2 capp ing法[8]等等方法。这些方法的基本设想都是在c DNA的5′端上连接一个已知的寡核苷酸，然后再用一个3′端特异性引物和锚引物对锚连接的c DNA 进行体外PCR扩增和克隆。
213 PCR扩增及产物的克隆
在RA CE中使用PCR产生大量目的产物时，一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不
确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；另一方面，可能根本就没有扩增到任何产物。为此，要增加PCR产量和扩增效率，提高扩增产物的特异性，可在RA CE中采用近几年日益完善的PCR扩增和克隆技术，值得重视的有热启动PCR(ho t start PCR)，长距离PCR(long distance PCR)和降落PCR(touchdow n PCR)等。对于RA CE反应中普遍存在的非特异性扩增，尤其是由通用引物引发的线性化非特异性扩增导致反应失败的情况,1996年, Chench ik[14]等利用抑制PCR(supp ressi on PCR)技术改进RA CE程序，可大大减少非特异性的线性化扩增。另外其他因素如引物设计、热反应参数、产物克隆的条件等也都会影响PCR扩增反应，近来已有许多改进PCR扩增的有效方法及质量控制[15,16]，有专门文献介绍，这里就不再赘述。
3 RACE技术的最新研究进展
311 M ara thon protocol of PCR c D NA am pl if ica2 tion[17,18]
1995年C lon tech公司推出的M arathon PCR，实际上是综合5′和3′端RA CE的优势，避免了当使用带有N或C端终末蛋白编码区的引物时，导致在c DNA序列的5′或3′端核苷编码区出现某些不确定或不明确的序列。它利用已产生的有连接接头的双链c DNA文库，来作为3′和5′RA CE反应的模板，这种c DNA可用来代替含多聚A尾的RNA或逆转录合成的c DNA。M arathon PCR的主要特色是综合利用长距离PCR和抑制性PCR技术保证获取更长的RA CE产物，克服了末端转移酶的局限性，降低了扩增过程中的背景，从而较为完整的得到全长c DNA，特别是3′末端,1999年Yam abe等即利用此方法得到小鼠的rep28基因全长。
由于M arathon PCR只对RA CE进行了局部改进，仍存在着一些缺陷，如5′端c DNA末端的获得还不完整,c DNA接头连接的效率问题等,C lon2 tech公司于1999年就推出了更为全面和高效的S M A R T技术代替M arathon PCR技术。
汤唯 英文312 S M ART(switch i ng m echan is m a t5′-end of RNA Tran scr ipt)
Sm art2RA CE技术的c DNA合成技术最近广受欢迎[19,20]，在于其最大限度地提高了在反转录反应中获取全长c DNA的可能。其机制参见图2，当反转录酶反应进行到m RNA模板的5′末端时表现出末端转移酶活性，并在c DNA第一链的3′端加上3～5个残基(主要是dC)，而此时由于Sm art2RA CE
技术提供的寡核苷酸引物在3′端含几个dG ，则两者退火，使反转录反应发生跳移并以该寡核苷酸为模
板继续反转录，反转录完成获得的产物必是全长的m RNA 及含引物的c DNA ，此产物可用于RA CE 2PCR 获取较完整的5′c DNA 末端。上述技术合成的c DNA 只利用于5′2RA CE 反应，称为5′2RA CE 2ready c DNA ；同时，一个修饰的o ligo (dT )引物用于传统反转录方法合成c DNA ，称为3′2RA CE 2R eady
c DNA 。由于Sm art 2RA CE 提供的o ligo 顺序既存在
于5′c DNA 端，又存在于3′c DNA 端，所以只需一种引物和基因特异引物配对即可扩增出5′和3′RA CE 产物，而且只需c DNA 第一链为模板，无需进行c D 2NA 第二链的合成，也无需接头的连接，既节约了时间，减少了程序，又易于得到RA CE 结果
。
图2 S M A R T 2RA CE 原理
RA CE 技术曾因没有足够的起始材料分离出
足够的高质量的m RNA ，而转为使用to tal RNA ，这易于导致非特异性的背景条带的出现。通过选择最优化的PCR 反应条件和在RA CE 中引入降落PCR ,Sm art 2RA CE 很好地解决了这个难题，利用m RNA 或总RNA 为起始材料扩增极低丰度的转录
信息，甚至少至50ng 的总RNA 也可进行Sm art 2RA CE 反应。
对于只有少量的起始材料RNA (例如只有50ng 的总RNA ),Sm art 2RA CE 应用了长距离PCR 的方法，改进的o ligo (dT )引物引导c DNA 第一链
的合成,S M A R T 的寡核苷酸引物作为m RNA 的5′末端的较短的延伸模板。当反转录反应到达m RNA 的5′末端时，酶改变模板继续对S M A R T 的寡核苷酸引物末端进行复制，结果全长单链DNA 包含有m RNA 的5′
端全长和与引物互补的序列，作为一个引物位点(S M A R T 锚定引物)在随后的LD 2PCR 中进行扩增，也只有在5′端序列中含有S M A R T 锚定引物的单链c DNA 才能作为模板参与随后的指数扩增，而非全长的c DNA 和以po ly 2A 2为模板转录的c DNA 不含有S M A R T 锚定引物，因此就不能被扩增。
这种选择性扩增就能从纳克级别的总RNA 或Po ly 2A +创建高比例的全长c DNA 文库。
而对于有较丰富的起始材料的RNA (如1Λg 或更多),c D 2NA 合成则采用引物延伸代替了LD 2PCR 步骤。同上述的第一链c DNA 合成相似，引物引导c DNA 第一链的合成,S M A R T 的寡核苷酸引物作为m RNA 的5′末端的较短的延伸模板，这样在第一链c DNA 合成后，经过引物延伸步骤就能产生全长的双链c DNA 。
总之,Sm art 2RA CE 与传统RA CE 方法相比，其技术特点是很明显的，它更完整地得到目的c D 2NA 的5′RA CE 产物，包括转录起始位点；无需接头连接，以c DNA 第一链直接用于RA CE 2PCR ，更简单、更快速；利用touchdow n PCR 技术，提高敏感性，降低背景；利用含Po ly (A )的RNA 或to tal RNA 甚至低丰度的转录产物作为起始材料用于克
隆全长c DNA 。因此，此方法现已广泛应用于c DNA 末端的快速扩增，尤其是5′末端。
313 RACE 技术与生物信息学资源的结合—“电子”c D NA 文库筛选
EST (exp resd quence tags )是一组短的c D 2NA 部分序列，是由大量随机取出c DNA 克隆一次
测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签，其
在基因组研究中的应用已相当广泛并具有良好的前景[21]。采用生物信息学的方法延伸EST 序列并结
合RA CE 进行“电子”c 文库筛选[22]
，是新近发展的利用此庞大数据库的重要方法。
“电子”c DNA 文库筛选主要是指在RA CE 基础上，采用生物信息学的方法延伸EST 序列，以获得基因的部分乃至全长c DNA 序列。基本过程为：利用3′和5′RA CE 技术，获得某基因的3′
或5′末端序列，再采用BLA ST 检索程序检索Genebank 的
dbEST 数据库，检出与3′
或5′末端有同源性的或有部分重叠的EST 序列；把检出序列组装成连续体；以此连续体序列为被检序列再进行BLA ST 检索；重复以上过程，直至没有更多的重叠EST 检出或连续体序列不能继续延伸。许多EST 所对应的c DNA 克隆可通过基因组及其表达的整合分子分析(in te 2grated m o lecu lar analysis of genom es and their ex 2
p ressi on ,I M A GE )协定免费索取，这同“电子”c D 2
NA文库筛选相辅相成。I M A GE协定[23]由美国LLNL国家实验室主持，宗旨是共享排列好的c D2 NA文库中的克隆。当研究者通过另外的途径得到基因的部分序列，通过同源性检索后发现该片段与加入I M A GE协定的EST序列高度同源时，便可免费索取其原始克隆，免去或减轻筛选全长基因的麻烦。
“电子”c DNA文库筛选法与经典的RA CE技术相比显然高效、快速、方便，但也要注意该方法有可能出现错误拼接。为此，在拼接中可利用多个不同来源的EST，必要时经过PCR及测序的验证，可保证结果的可靠性。从数据库中克隆到的c DNA顺序，尚需进一步的N o rthern印迹和 或R T2PCR加以证实。
人类基因组测序工作大量完成,EST数据库迅速扩展，没有被EST项目检测过的基因将会越来越少，因此在克隆基因的全长c DNA序列以前，很有必要先采用生物信息学的方法进行“电子”c DNA文库筛选，以指导下一步实验策略。
RA CE的成功应用充分显示了它是一种快速、有效地克隆全长c DNA，特别是从微量m RNA克隆全长c DNA的手段，近年来，除了对原有技术的改进外，新方法的设计(如o ligo2capp ing法)及别的方法的借用(如“电子”c DNA文库筛选法)等也占了相当的比例。相信随着优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高以及PCR产物克隆技术的进步，借鉴并结合其他领域中的最新研究成果,c DNA末端快速扩增的方法将更加成熟与完美。
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(2000212201 收稿)
嗜甲醇酵母表达系统研究进展
陈 琳 张亚东
军事医学科学院野战输血研究所(北京,100850)
jeanette 摘要 以毕赤酵母(P.p astoris)为代表的嗜甲醇酵母，作为一种新的外源蛋白表达系统，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。该系统具有操作技术简单、可进行高水平的分泌型表达、可对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰与加工等显著优点。本文从表达载体(包括新的启动子，选择标志)、宿主菌株、发酵培养、表达产物的翻译后修饰等方面介绍了嗜甲醇酵母表达系统的最新进展。
关键词 嗜甲醇酵母; 基因表达调控
酵母作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核细胞表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。酿酒酵母(S ac2 cha ro m y ces cerev v isiae)是最早用于表达异源蛋白的酵母菌，但它具有一定的局限性[1]。此后又有多种酵母用于表达异源蛋白，但上述局限性仍未得到明显改善。因此，人们将焦点转移到嗜甲醇酵母。
