Code No. CY220 研究用
Cycleave®PCR Vibrio (tdh
gene) Detection Kit
runwinzip说明书
v201211Da
目录
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affable●制品说明1●制品内容1●保存 2 ●试剂盒外必备材料 2 ●操作注意事项2●操作流程2●结果判定7●参考文献8 ●相关制品8
● 制品说明
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus ）是一种嗜盐性细菌，该菌主要存在于近海岸的海水、海底沉积物及鱼贝类等海产品中，是日本、美国及东南亚国家食物中毒和急性腹泻病的重要病原菌。该病原菌
产生的耐热溶血性毒素（TDH ）是食物中毒病原体之一。
本制品是以耐热溶血性毒素基因（tdh 基因）为目的基因，使用Real Time PCR 方法进行检测的试剂盒。采用Cycling Probe 法对检测tdh 基因的探针用FAM 标记，内参照检测探针用ROX 标记，在同一反应管内对
tdh 基因及内参照（Internal Control ）同时进行扩增，通过两种不同荧光标记探针可以对tdh 基因和内参照基因同时检出，实现双通道同步检测。其中使用了改良后的Hot Start 法用 DNA 聚合酶TaKaRa Ex Taq HS ，
可有效防止在循环反应前因引物错配、引物二聚体所产生的非特异性扩增，可进行高灵敏度的检测。本检测无需电泳，简单快速，灵敏度高、特异性强。
Cycling Probe 法是由RNA 和DNA 构成的杂合探针与RNa H 组合使用的高灵敏度检出法，能够高效率地检出扩增过程中及扩增结束时的目的基因片段。Cycling probe 内部含有RNA 碱基，一端标记荧光物质，另一端标记荧光淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNa H 在RNA 部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光（如图1），通过测定荧光强度，能够实时监控扩增产物量。
本试剂盒是与静冈环境和卫生研究所的Dr. Kenji Sugiyama 共同开发制造的。
图1．Cycling Probe 法原理
● 制品内容（25 μl 反应体系×50次量）
1．2×Cycleave Reaction Mixturemark zuckerberg
2×conc. 625 μl 2．TDH Primer/Probe Mix （FAM 、ROX 标记）＊ 5×conc. 250 μl
3．TDH Positive Control
150 μl （30次量） 4．dH 2O
联系人英文翻译1 ml六级词汇
*：Primer 由岛津制作所制造，含有荧光标记探针要注意避光存放。 【制品组份说明】
2×Cycleave Reaction Mixture ：含有反应必需的酶、Buffer 、dNTP Mixture 。
TDH Primer/Probe Mix ：含内参照、靶基因检测用Primer/Probe 的混合液。使用引物对靶基因和内参照基因
分别进行扩增，由不同荧光物质标记的探针分别对靶基因或内参照基因进行特异性检出。靶基因检测用探针由FAM 标记、内参照检测用探针由ROX 标记。
内参照DNA ：是含有与靶基因序列无关的DNA 分子，用于判断假阴性结果。所有反应体系中都有内参对照，
如果靶基因无检出，而内参对照有检出，可判定PCR 反应无阻害，靶基因在检出界限以下。如果靶基因、内参对照均无检出，可判定PCR 反应不正常。另外，靶基因DNA 量多时，靶基因的扩增反应会优先进行，导致内参对照的起峰较晚、荧光信号强度弱或无信号，这时判定靶基因为阳性。
dH 2O ：灭菌水
TDH Positive Control ：tdh 基因阳性对照。
-1-
荧光物质
荧光淬灭物质 RNA
Cycling Probe 扩增产物
杂交
RNa H
在RNA 部分切断
荧光强度增大
RNa H
●保存：−20℃（保存及运输）。
●试剂盒外必备材料
【仪器】
∙Real Time PCR仪及专用tube
Thermal cycler Dice Real Time system // (Code No.TP900/TP960)
Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR system (Life Technologies) etc.
0.2 ml的八联管需要额外购买，使用该产品可降低操作的污染风险，所以推荐使用。
∙0.2 ml的八联管，独立平盖（Code No.NJ 600）
∙加热模块（可设定温度95℃）
【其它】
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1. 200 μl、20 μl 、10 μl移液枪
2．移液枪用Tip（带疏水性过滤膜）
3. 小型桌面离心机
4. 微量高速离心机（可设定4℃）减肥 英语
●操作注意事项
1. 请按照Real Time PCR仪的使用说明书进行操作。
2. 如果探针、引物因混入核酸酶而被降解，则不能准确检测。实验者的汗液和唾液也可能会带入核酸酶，
操作中应注意。
3. 判定为阳性的样品，请使用微生物学方法再次确认。
4. 为防止污染，建议从反应液的配制到检测，设定以下3个区域，进行物理隔离。
区域1：反应液的配制及分装。
区域2：检测样品的制备。
区域3：向反应液中添加检测样品，进行反应、检出。
由于本Kit使用Real Time PCR法，扩增反应与检测同时进行，反应后的扩增产物无需进行电泳。另外，为了避免污染，严禁从Tube中取出扩增产物。
5. 本Kit是使用Real Time PCR扩增仪对结果进行分析、判定。当Real Time PCR扩增仪的Auto功能不
适合时，将会导致结果判定错误。如有需要，可参照Real Time PCR扩增仪说明书进行Manual设定。
●操作流程
1．样品的制备。
2．Real Time PCR仪的设定
3．反应液的配制与开始反应
配制反应液
capital city
↓
将反应液分装到反应管中，添加阴性对照、检测样品、阳性对照。
↓
将反应管放入Real Time PCR仪中，开始反应。
↓
4．结果表示
画面显示Real Time PCR扩增曲线
↓
反应完成
↓
结果判定
-2-
1．样品的制备（在区域2进行）
【菌体直接进行PCR反应时】
1）用已灭菌的微量移液枪枪头等从平板（TCBS琼脂培养基＊1）上挑取少量菌体后，加500 μl灭菌水悬浮。
2）95℃，热处理5分钟。
3）离心，取5 μl上清用于PCR反应。
【结合细菌培养法，从食品中回收细菌后进行PCR反应时】
1）向实验材料中加入10倍的食盐多粘菌素肉汤＊2，用细菌匀浆器（Stocker等）破碎混合后，37℃培养数小时或过夜培养。
2）将1 ml细菌培养液10,000 rpm离心3 min。
3）弃上清，用500 μl TE Buffer（10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH8.0）悬浮沉淀后，95℃热处理5分钟。
4）离心分离，取5 μl上清用于PCR反应。进行PCR反应时，如果有阻害反应，则将样品稀释后再进行PCR反应。
＊1：TCBS培养基：日水制药
＊2：食盐多粘菌素肉汤：日水制药
2．反应液的配制
本试剂盒可在一个反应管中对tdh基因和内参照基因的扩增产物同时进行检出。为得到正确的检测结果，同时进行tdh基因阳性对照反应（TDH Positive Control）和阴性对照反应。
【注意】为了增加实验结果的准确性，建议每个样品至少进行2管反应。
1）在冰上配制如下反应液。（在区域1进行）
除检测样品以外的反应组份配制成Master mix（反应管数+α份），将20 μl反应液分装到反应Tube 后，其中一管加入5 μl灭菌水作为阴性对照后，盖紧盖子。
*：在这个区域不添加检测样品等模板。
【注意】因为是定量检测，所以在盖Tube盖时要戴手套，避免污染。（转移到区域3）
2）样品（模板）的添加。（在区域3进行）
除阴性对照外，剩余的反应管添加样品或Positive Control，盖紧盖子。
将反应管用小型桌面离心机轻微离心后，放入Real Time PCR仪中。
【注意】反应液配制后，尽量在1小时内进行反应。八阵图杜甫
3．Real Time PCR扩增和检测（在区域3进行）简爱英文版读后感
每种Real Time PCR仪的操作方法有所不同，详细操作方法请参照其说明书。以下简单介绍一下使用Thermal Cycler Dice Real Time System II及Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System （Life Technologies）的操作方法及结果判定。
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