ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎＡｓｔｒａｇａｌｕｓａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙＬＩＳｈｕ ｄｉ１，ＷＡＮＧＺｈｅｎ２，ＬＩＵＪｉａｎｇ ｋａｉ２，ＬＩＸｉａｎｇ ｘｉａｎｇ１，ＹＡＮＧＸｉｎｇ１，ＤＵＡＮＦｅｉ２，ＬＩＳｕ ｌｉｎｇ２（１．ＴｈｅＦｉｒｓｔＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ；２．ＤｅｐｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｉｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｍｏｓｔｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓ ｅａｓｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ａｎｄｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｉｄｅａｌａｎｔｉ ｆｉｂｒｏｔｉｃｄｒｕｇｓａｖａｉｌａ ｂｌｅ．Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｈａｓａｌｏｎｇｈｉｓｔｏｒｙｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｕｓｅ，ａｎｄｉｔｓａｎｔｉ ｆｉｂｒｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｈａｖｅｂｅｅｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｍｏｄｅｒｎｓｔｕｄｉｅｓ．ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｈａｖｅｓｅａｒｃｈｅｄｔｈｅｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｔｉｏｎｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓａｎｄ
ｉｔｓａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｏｎｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｓｏａｓｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｂａｓｉｓａｎｄｉｄｅａｓｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｔｉ ｆｉｂｒｏｔｉｃｄｒｕｇｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓ．Ｉｔｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉ ｅｎｔｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓａｃｔｔｈｒｏｕｇｈｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｐ３８ＭＡＰＫ，ＴＧＦ β１／Ｓｍａｄｓ，ＮＦ κＢ，ＰＰＡＲγ，Ｎｏｔｃｈ，ＰＡＲ２，ＰＧＥ２／ＥＰ２／ｃＡＭＰｔｏｒｅ ｄｕｃｅｌｉｖｅｒｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ，ｉｎｈｉｂｉｔｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌ ｌａｔｅｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｐｒｏｍｏｔｅｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｉｎｈｉｂｉｔｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄｒｅｄｕｃｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｓｙｎｔｈｅ ｓｉｓｔｏａｃｈｉｅｖｅｔｈｅａｎｔｉ ｆｉｂｒｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔ，ｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｍｕｌｔｉ ｔａｒｇｅｔ，ｍｕｌｔｉ ｐａｔｈｗａｙａｎｄｍｕｌｔｉ ｌｅｖｅｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｓｔｒａｇａｌｕｓａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ；ｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ；ｐａｔｈ ｏｇｅｎｅｓｉｓ；ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ；ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎ；ｐａｔｈｗａｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
网络出版时间：２０２２－１２－０９１８：２１：４１ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／／３４．１０８６．ｒ．２０２２１２０９．１４２７．００７．ｈｔｍｌ◇皮肤药理学◇
薄荷醇通过调节角质形成细胞内钙离子浓度而产生促透作用
刘文彬１，黄 钊２，王 晖２
（１．广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东省生物活性药物研究重点实验室，
２．广东药科大学中药学院，广东广州 ５１０００６）
ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０１０３９
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０１－００２３－０６中国图书分类号：Ｒ３２２．９９；Ｒ３２９．２４；Ｒ３４８．１；Ｒ９７７．３
摘要：目的 研究薄荷醇促透作用的可能机制。方法 原代培养人角质形成细胞，考察薄荷醇对ＫＣ细胞连接紧密性的影响，流式细胞术测定对ＫＣ细胞内Ｃａ２＋浓度的影响，试剂盒法测定对ＫＣ细胞内Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶活性、ＰＬＣ活性、ＰＫＣ活性和ＡＴＰ含量的影响，考马斯蓝染色测定对Ｋ
Ｃ微丝骨架结构的影响。结果 与空白对照组相比，薄荷醇能明显降低ＫＣ间连接紧密性、Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶活性和ＡＴＰ含量，增加细胞内Ｃａ２＋浓度、ＰＬＣ活性和ＰＫＣ活性，ＫＣ细胞间隙明显增加。与２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组相比，联合使用ＰＬＣ阻滞剂Ｕ７３１２２和钙离子通道阻滞剂硝苯地平后，均能增加ＫＣ间连接紧密性，降低胞内Ｃａ２＋浓度。结论 薄荷醇通过增加ＫＣ
收稿日期：２０２２－０８－１３，修回日期：２０２２－１１－０４
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１０７２５９１）
作者简介：刘文彬（１９８８－），男，博士，助理研究员，研究方向：中药药理，Ｅ ｍａｉｌ：４０８０１１１２６＠ｑｑ．ｃｏｍ；
王 晖（１９６４－），男，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：
皮肤药理和数学药理，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｄｗａｎｇｈｕｉ２００６＠
１２６．ｃｏｍ胞内Ｃａ２＋浓度发挥促透作用，这与其增强ＰＬＣ活性、促进外源性Ｃａ２＋内流有关。
关键词：薄荷醇；促透机制；经皮吸收；钙离子；磷脂酶Ｃ；蛋白激酶Ｃ
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
药物经皮吸收进入血液循环是一种给药途径，但是皮肤屏障在保护机体免受外界损伤的同时，也限制了药物经皮吸收的速率，应用皮肤吸收促进剂（ＰＥ）是增加药物经皮吸收的一种常用方法［１］。薄荷醇是一种单萜类物质，作为ＰＥ已得到广泛应用。目前针对薄荷醇促透机制的研究尚存在争议，如Ｙａｎｇ等［２］研究认为，薄荷醇在低浓度下破坏角质层有序的脂质结构，高浓度改善药物在角质层中的分配发挥促透作用；Ｈｕａｎｇ等［３］研究发现，薄荷醇可直接改变脂质的厚度和流动性，促进槲皮素的跨膜转
运；Ｃｈｅｎ等［４］研究认为，薄荷醇发挥促透作用主要从两个方面，一是竞争脂质－脂质氢键位点，从而降低脂质稳定性，二是薄荷醇具有很强的胆固醇亲和力，可增加类脂膜的流动性。在本课题组的前期研究中通过光镜、扫描电镜、透射电镜观察发现，应用薄荷醇后可导致皮肤角质层细胞间隙增大和细胞排列发生改变［５－６］，但是，薄荷醇如何引起上述变化而发挥促透作用的分子机制尚不清楚。因此，本研究在体外建立角质形成细胞单层模型，考察薄荷醇的体外促透作用的可能机制。
１ 材料与方法
１．１ 试剂和抗体 ＦＩＴＣ ＢＳＡ购自于北京索莱宝科技有限公司（货号：ＳＦ０６３）；Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ＳＦＭ培养基购自于美国Ｇｉｂｃｏ公司（货号：１１３４２１０）；Ｕ７３
１２２购自于美国Ｓｉｇｍａ公司（批号：Ｕ６７５６）；硝苯地平购自于美国Ｓｉｇｍａ公司（批号：０４０Ｍ１９１２０）；白屈菜红碱购自于上海晶纯试剂有限公司（批号：Ｃ１０７６８６）；薄荷醇购自于上海晶纯试剂有限公司（批号：１１０７１６）；考马斯亮蓝（Ｒ２５０）购自于北京鼎国生物技术有限责任公司（批号：６９Ｐ１０１５０）；ＡＴＰ含量检测盒购自于南京建成生物工程所（批号：２０１２０３２１）；超微量Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶试剂盒购自于南京建成生物工程所（批号：２０１２１００９）；Ｆｌｕｏ ３／ＡＭ荧光探针购自于碧云天生物技术研究所（批号：Ｓ１０５６）；ＰＬＣＥＬＩＳＡ试剂盒购自于上海百沃科贸有限公司（批号：ＢＶ Ｅ１２１０２２）；ＰＫＣＥＬＩＳＡ试剂盒购自于上海百沃科贸有限公司（批号：ＢＶ Ｅ１１０９０５）。
１．２ ＫＣ的原代培养 包皮组织移入０ ２５％Ｄｉｓ ｐａｓｅⅡ分离表皮和真皮，表皮剪成碎片，３７℃下使用胰蛋白酶水解消化５～７ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ收集细胞。使用ＫＣ ＳＦＭ培养基，在５％ＣＯ
２
、３７℃、９０％湿度条件继续培养至融合度达到８０％～９０％，０ ２５％胰酶消化传代。
１．３ 薄荷醇对ＫＣ单层细胞模型连接紧密性的影响 胰蛋白酶消化重悬细胞，调整细胞数量为１×１０４／孔，接种至１２孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（孔径０ ４μｍ）小室内，培养至细胞完全融合。用
含有不同药液的培养基培养细胞２ｈ后，检测细胞电阻抗（ＴＥＥＲ），每组设３个复孔。１×１０４ＫＣ细胞接种至Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室内至融合后，内室换为含０ ０５ｇ·Ｌ－１ＦＩＴＣ ＢＳＡ的培养基，外室中加入含有不同药液的培养基培养细胞６ｈ后，收集内室液体。激发波长５２０ｎｍ，发射波长４９２ｎｍ，荧光分光光度计测定内室液体吸光度值［７］。
１．４ 薄荷醇对ＫＣ细胞内Ｃａ２＋浓度的影响 ＫＣ细胞分为不同组别，添加不同组别的培养基继续培养５ｍｉｎ，离心沉淀细胞，吸去培养基。将细胞重悬于终浓度为２μｍｏｌ·Ｌ－１Ｆｌｕｏ ３／ＡＭ溶液，３７℃避光孵育３０ｍｉｎ。激发波长４８８ｎｍ，发射波长５２５ｎｍ，流式细胞仪测量细胞的荧光强度。
１．５ 薄荷醇对ＫＣ细胞内Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶活性、ＰＬＣ活性、ＰＫＣ活性和ＡＴＰ含量的影响 将ＫＣ根据实验分组，加入相应的培养基后培养４ｈ。细胞消化，离心，收集细胞，匀浆器破碎细胞制备细胞悬液，采用试剂盒检测Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶活性、ＰＬＣ活性、ＰＫＣ活性。同法细胞培养４ｈ后，收集细胞，９０℃～１００℃水浴匀浆破碎，沸水浴中加热１０ｍｉｎ，采用试剂盒检测ＡＴＰ含量。
１．６ 薄荷醇对ＫＣ微丝骨架结构的影响 接种ＫＣ于预置玻片的６孔板中，细胞贴壁后４８ｈ，加入相应的培养基后培养细胞４ｈ。参考文献方法［８］，对培养的细胞依次进行２ ５％戊二醛固定、考马斯亮蓝染色，玻片置于甲醇冰醋酸溶液中脱色。倒置显微镜下观察、拍照。
１．７ 统计学分析 所有数据均以珋ｘ±ｓ表示，使用ＳＰＳＳ１９ ０进行统计学处理，组间比较采用ｔ检验和单因素方差分析。
２ 结果
２．１ 薄荷醇对ＫＣ单层细胞模型连接紧密性的影响 分别采用０、５０、１００和２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇处理ＫＣ单层细胞模型，测定ＴＥＥＲ和ＦＩＴＣ ＢＳＡ渗透量。结果显示，薄荷醇能剂量依赖性降低ＴＥＥＲ和增加ＦＩＴＣ ＢＳＡ渗透量（Ｐ＜０ ０５），表明薄荷醇能降低ＫＣ细胞间的连接紧密性。相对于２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组，１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组和１００μｍｏｌ·Ｌ－１硝苯地平＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组ＴＥＥＲ明显升高（Ｐ＜０ ０５），ＦＩＴＣ ＢＳＡ渗透量明显降低（Ｐ＜０ ０５），表明ＰＬＣ抑制剂Ｕ７３１２２和钙通道阻滞剂硝苯地平可以逆转薄荷醇引起的ＫＣ连接紧密度下降，见Ｆｉｇ１。
２．２ 薄荷醇对ＫＣ细胞内Ｃａ２＋浓度的影响 流式细胞仪结果显示，薄荷醇能剂量依赖性增加ＫＣ细胞内Ｃａ２＋浓度（Ｐ＜０ ０５）。１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组和１００μｍｏｌ·Ｌ－１硝苯地平＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组胞内Ｃａ２＋浓度明显低于２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组（Ｐ＜０ ０５），表明ＰＬＣ抑制剂Ｕ７３１２２和钙通道阻
滞剂硝苯地平可以降低薄荷醇引起的ＫＣ细胞内Ｃａ２＋浓度升高，见Ｆｉｇ２。２．３ 薄荷醇对ＫＣ细胞内Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶、ＡＴＰ的影响 薄荷醇能剂量依赖性降低ＫＣ细胞内Ｃａ２＋
Ｆｉｇ１ ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｅｎｔｈｏｌｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎｔｉｇｈｔｎｅｓｓｏｆＫＣｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｅｌｌｍｏｄｅｌ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）Ｌｅｆｔｆｉｇｕｒｅ：Ｔｈｅｅｆｆｅ
ｃｔｏｆｍｅｎｔｈｏｌｏｎＴｅｅｒｂｅｔｗｅｅｎＫＣｓ；Ｒｉｇｈｔｆｉｇｕｒｅ：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｅｎｔｈｏｌｏｎＦＩＴＣ ＢＳＡｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇＫＣｍｏｎｏｌａｙｅｒ．Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂ：５０μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｃ：１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｄ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｅ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ＋１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ，Ｆ：１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ，Ｇ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｈ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓ２００μｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｅｎｔｈｏｌｇｒｏｕｐ
．
Ｆｉｇ２ ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｅｎｔｈｏｌｏｎｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＣａ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＫＣ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂ：５０μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｃ：１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｄ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｅ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｆ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２，Ｇ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ＋１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ，Ｈ：１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０５ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓ２００μｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｅｎｔｈｏｌｇｒｏｕｐ．
ＡＴＰ酶活性和ＡＴＰ含量（Ｐ＜０ ０５）。１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组胞内Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶活性和ＡＴＰ含量高于２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组（Ｐ＜０ ０５），表明ＰＬＣ抑制剂Ｕ７３１２２可以降低薄荷醇引起的ＫＣ细胞内Ｃａ２＋浓度升高，见Ｆｉｇ３
。
Ｆｉｇ３ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｎｔｈｏｌｏｎＣａ２＋ ＡＴＰａｓｅａｎｄ
ＡＴＰｉｎＫＣ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂ：５０μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｃ：１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎ ｔｈｏｌ，Ｄ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｅ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｆ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２． Ｐ＜０ ０５ｖｓＣｏｎ ｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０ ０５，＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓ２００μｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｅｎｔｈｏｌｇｒｏｕｐ．
２．４ 薄荷醇对ＫＣ细胞ＰＬＣ活性的影响 薄荷醇能剂量依赖性增加ＫＣ细胞内ＰＬＣ活性（Ｐ＜０ ０５）。１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组胞内ＰＬＣ活性低于２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组（Ｐ＜０ ０５），表明ＰＬＣ抑制剂Ｕ７３１２２可以降低薄荷醇引起的ＰＬＣ活性升高，见Ｆｉｇ４。
２．５ 薄荷醇对ＫＣ细胞ＰＫＣ活性的影响 薄荷醇能剂量依赖性增加ＫＣ细胞内ＰＫＣ活性（Ｐ＜０ ０５）。１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组和５μｍｏｌ·Ｌ－１白屈菜红碱＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇ＰＫＣ活性低于２００μｍｏｌ·Ｌ－１薄荷醇组（Ｐ＜０ ０５），表明ＰＬＣ抑制剂Ｕ７３１２２和ＰＫＣ抑制剂白屈菜红碱可以降低薄荷醇引起的ＰＬＣ、ＰＫＣ活性升高，见Ｆｉｇ５
。
Ｆｉｇ４ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｎｔｈｏｌｏｎＰＬＣｉｎＫＣ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂ：５０μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｃ：１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎ ｔｈｏｌ，Ｄ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｅ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｆ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２． Ｐ＜０ ０５ｖｓＣｏｎ ｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓ２００μｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｅｎｔｈｏｌｇｒｏｕｐ
．
Ｆｉｇ５ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｎｔｈｏｌｏｎＰＫＣｉｎＫＣ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂ：５０μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｃ：１００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎ
ｔｈｏｌ，Ｄ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｅ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２＋２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｆ：１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｕ７３１２２，Ｇ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ＋５μｍｏｌ·Ｌ－１ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ，Ｈ：５μｍｏｌ·Ｌ－１ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０５ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓ２００μｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｅｎｔｈｏｌｇｒｏｕｐ．
２．６ 薄荷醇对ＫＣ微丝骨架结构的影响 考马斯亮蓝染色结果显示，角质形成细胞呈不规则鹅卵石形状，细胞间连接紧密（Ｆｉｇ６Ａ）。薄荷醇处理以后，角质形成细胞显著收缩，细胞间可见明显的间隙（Ｆｉｇ６Ｂ）。不同浓度白屈菜红碱处理后，可明显逆转薄荷醇引起的角质形成细胞间隙增大（Ｆｉｇ６Ｃ和Ｆｉｇ６Ｄ）。
３ 讨论
既往的对ＰＥ促透机制研究多集中于促透剂对角质层中生化成分的结构、状态及构象的影响，如改变角质层脂质排列的有序性和相变温度［９］、加快角蛋白碳的运动、增加角质层的无序性而促进药物的吸收等［１０］，而忽略了ＰＥ对细胞与细胞之间连接的影响。表皮分为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。角质层主要由ＫＣ细胞组成，相互连接的ＫＣ细胞构成了表皮的主要屏障。ＫＣ间连接的紧密程
Ｆｉｇ６ Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｎｔｈｏｌｏｎｍｉｃｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ
ｓｋｅｌｅｔｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎＫＣ（
１０００×）Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｎｔｈｏｌ，Ｃ：２００μｍｏｌ·Ｌ－１
ｍｅｎ ｔｈｏｌ＋５μｍｏｌ·Ｌ－１ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ，Ｄ：５μｍｏｌ·Ｌ－１
ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ．
度直接影响表皮的渗透性及其功能
［１１］
，而药物经皮
吸收的一个重要途径就是细胞间隙扩散，细胞之间连接的紧密程度直接影响了药物的经皮吸收量。因此本文以人原代角质形成细胞为研究对象建立了ＫＣ单层模型，考察薄荷醇对ＫＣ细胞模型的连接紧密性的影响。研究结果显示，薄荷醇可明显的降低细胞间的连接紧密程度，降低细胞间ＴＥＥＲ，增加ＦＩＴＣ ＢＳＡ的跨膜渗透量。
在正常的表皮中，由内到外从基底层到角质层
Ｃａ２＋浓度逐渐升高。Ｃａ２＋
浓度对于维持ＫＣ细胞的
正常功能具有重要作用，如促进ＫＣ细胞的增殖、分
化和皮肤修复等［１２］
。有研究报道，ＫＣ细胞内外的
Ｃａ２＋
浓度发生变化，可导致ＫＣ细胞间的间隙增大，从而增大皮肤对药物的渗透性
［１３］
。我们通过流式
细胞术显示，薄荷醇可以增加细胞内的Ｃａ２＋浓度。
因此，我们推测薄荷醇的促透作用可能与薄荷醇增
加细胞内的Ｃ
ａ２＋
浓度有关。 那薄荷醇是如何影响ＫＣ细胞内Ｃａ２＋
浓度的呢？细胞内的Ｃａ２＋
主要来源于两个方面，一是由细胞膜上钙离子通道从胞外直接流入胞内，二是通过
内源性钙池释放［
１４］
。内源性钙池由ＰＬＣ调控，细胞膜上的ＰＬＣ被激活后可促进４，５ 二磷酸磷脂酰胺肌醇（４，５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｙｌｉｎｏｓｉｔｉｄｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＩＰ２）水解形成三磷酸肌醇（ｉｎｏｓｉｔｏｌ １，４，５ ｔｒｉｐｈｏ ｓｐｈａｔｅ，ＩＰ３）和甘油二酯（ｄｕａｃｙｋｙｃｅｒｏｌ，ＤＡＧ），ＩＰ３增加后可
促进钙池释放Ｃａ２＋，从而使胞内Ｃａ２＋浓度升高［１５］
。ＰＩＰ２水平下降可降低胞内Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶活性。ＤＡＧ
可促进ＡＴＰ外流，降低胞内ＡＴＰ浓度，ＡＴＰ的减少同样可降低Ｃ
ａ２＋
ＡＴＰ酶活性［１６］
。Ｃａ２＋
ＡＴＰ酶（即
Ｃａ２＋泵）使胞内Ｃａ２＋
不能泵出到胞外，进一步间接增加胞内的Ｃａ２＋浓度［１７］。我们对ＫＣ单层模型分
别使用钙离子通道阻滞剂硝苯地平和ＰＬＣ阻滞剂
Ｕ７３１２２后，均可使胞内Ｃａ２＋浓度显著下降，薄荷醇
引起的细胞间的连接紧密程度下降也被逆转。因此，薄荷醇可能通过增强Ｐ
ＬＣ活性释放胞内钙池Ｃａ２＋，促进外源性Ｃａ２＋内流，共同增加胞内Ｃａ２＋浓
度。
ＰＫＣ是Ｇ蛋白偶联受体系统中的效应物，其激活既依赖膜脂甘油二酯的出现，又依赖细胞质中
Ｃａ２＋浓度的升高［１８］
。ＰＫＣ激活后，可参与多种生化
反应和基因表达的调控。在表皮ＰＫＣ激活后可使细胞某些蛋白磷酸化，而影响细胞的骨架结构和细胞膜稳定性，从而使屏障作用减弱。本实验证实薄荷醇可使ＫＣ细胞间的间隙增加，且该作用与ＰＫＣ的活性有关。因此，我们推断薄荷醇通过增加ＫＣ
胞内Ｃａ２＋浓度，上调ＰＫＣ活性，从而降低细胞间的
连接紧密性发挥促透作用。
综上，薄荷醇通过增加ＫＣ胞内Ｃａ２＋
浓度发挥促透作用，其增加胞内Ｃａ２＋浓度作用与增强ＰＬＣ活性，促进外源性Ｃａ２＋内流有关。
参考文献：
［１］ ＫｏｖáˇｃｉｋＡ，ＫｏｐｅˇｃｎáＭ，ＶáｖｒｏｖáＫ．Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｒｓｉｎ
ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｂｅｎｅｆｉｔｓａｎｄｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＤｒｕｇＤｅｌ，２０２０，１７（２）：１４５－５５．
［２］ ＹａｎｇＳ，ＷａｎｇＲ，ＷａｎＧ，ｅｔａｌ．Ａｍｕｌｔｉｓｃａｌｅｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｐｅｎｅ
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