2004年6月第14卷 第3期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNA L OF COMPARATIVE ME DICINE June ,2004
V ol.14 N o.3
综述与专论
实验动物垫料质量的评估
刘恩岐1
, 林
2
(1.西安交通大学医学院实验动物中心，西安 710061;2.日本冈山大学医学部附属动物实验设施)
【摘要】 实验动物垫料(Laboratory animal bedding )是影响实验动物健康和动物实验结果的国际公认
的重要环境因素之一，我国大多数实验动物生产和动物实验研究单位使用的垫料是来源不清楚的刨花(Shaving )和锯屑(Saw 2
dust )，质量得不到保证。国家实验动物管理机构和科研单位至今尚未开展实验动物垫料质量评估体系的研究，没
有可以参考的标准。本文回顾了实验动物垫料研究的历史和进展，从不同角度分析了垫料原材料来源、原材料安全性、垫料舒适性、吸收性、形状、大小以及垫料的加工、灭菌、包装、运输和储存等，讨论并提出了适合中国国情的实验动物垫料开发、研究思路和质量评估办法。
【关键词】 动物，实验；垫料
【中图分类号】Q95-331 【文献标识码】A 【文章编号】167127856(2004)0320179206
Criteria for Evaluation of Laboratory Animal Bedding
LI U En-qi 1
,Y UZ URU K urabayashi
2
(1.Medical School of X i ’an Jiaotong University ,X i ’an 710061,China ;2.Animal Center for Medical Rearch ,Okayama University Medical School )
【Abstract 】 Laboratory animal bedding should provide a surface that is hygienic and that fulfils both physical and chemical
requirements esntial to the health and well 2being of the animals.It should be chon in view of its abs orbent capacity ,its avail 2ability and low dust content.W ood appears to be the m ost suitable raw material for laboratory animal bedding.O f the s oftw oods ,pine and cedar are not usable becau of their high resin content of toxic substances for laboratory animal.Scientists dem onstrated s ome changes in micros omal oxidative enzyme activity and other damages in the m ou and rat depending on the bedding.Aspen ,birch ,fir ,and spruce em to be g ood s ources ,as well as corncob and recycled 2paper.Bad on preference testing ,the size and the shape might be the major factors in the suitability of bedding particles for laboratory rodent animals.Bedding consisting of large fibers ems to be preferred.S terilization is recommended.The paper reviews the history and development in criteria of biological evaluation of laboratory animal bedding ,with author ’s opinion about rodent laboratory animal bedding in China.
【K ey w ords 】 Animal ,laboratory ;Bedding
[作者简介]刘恩岐(1965-)男，副教授，研究方向：动物遗传育
种学。
1 引言
实验动物垫料分为接触性垫料(contact bedding )
和非接触性垫料(noncontact bedding )。木材(w ood )来源的垫料是最常用的接触性垫料1,2
。
实验动物垫料是影响实验动物质量和动物实验
结果重要的环境因素。垫料的作用是保温、隔热、吸
收粪尿和水分，垫料也是动物制作巢穴的材料。发达国家对实验动物垫料质量研究很重视，从上个世纪60年代开始一直进行相关的实验研究，很早就发现广泛使用的松木(pine )和雪松(cedar )垫料含有的特殊气味能引起人和动物发生免疫介导的过敏和炎症反应、哮喘和其他呼吸道疾病，还能造成气管和支气管上皮细胞脱落、坏死等，体外和体内动物
实验研究发现，松木和雪松垫料提取物不但诱导动物肝微粒酶(liver micros omal enzymes)，而且有细胞毒性及潜在的致癌性等3-9。
我国已建立了许多标准化的实验动物设施，饲料和饮水标准化已初步解决，并已制定成国家标准正式颁布。但是，对于实验动物质量有重大影响的垫料尚未进行系统调查、开发、研究。从20世纪90年代开始，虽然我国个别单位也进行了诸如蒲草10、芦苇11、泡桐刨花等12垫料的开发和比较研究，对垫料传播寄生虫、垫料的消毒方法等也进行了探讨。但总的来说，我国垫料研究工作还处于初级探索阶段，蒲草、芦苇等还没有商品化，绝大多数单位使用的垫料是来源不清楚的木材加工厂的副产品———刨花和锯屑，或者使用的对动物健康有影响的垫料(如，松树垫料)，质量得不到保证，而且没有很好灭菌处理，可能受到微生物污染，影响标准化实验动物的生产，干扰动物实验结果。
垫料问题已成为制约我国实验动物标准化的一个瓶颈，目前，我们亟需开展垫料原材料(raw materi2 al)及其理化特性、潜在的毒性、舒适性以及垫料加工(Manu facturing process)、包装(package)等开发、研究工作，建立垫料质量评估体系，供实验动物生产和动物实验研究单位、垫料生产企业参考。
2 垫料质量评价体系
2.1 垫料的原材料
木材是最常用的实验动物垫料的原材料，除此之外，常用的原材料还有：玉米芯(corncob)、再生纸(recycled2paper)、秸秆(straws)、果壳(hulls)及其他纤维类材料(plant fiber and others)等。
木材是实验动物最合适的垫料原材料，以木材刨花形式使用效果最佳。在木材垫料中，对动物健康有危害的松树和雪松类垫料也在广泛使用13。
其他原材料开发比较成功的是玉米芯和再生纸垫料。将玉米棒上的玉米粒剥下后剩余的玉米芯粉碎或制成小颗粒，作为玉米芯垫料。再生纸也是国外比较常用的垫料之一，是将废纸重新处理、软化，切成碎片、纸条或加工成纸团，当作垫料使用。国内一些单位正在开发研究的蒲草、芦苇等也可能成为较理想的垫料原材料。也有使用植物的秸杆、棉花等作为垫料。有些国家还使用蛭石(vermiculite)作为垫料。蛭石是含镁的水铝硅酸盐，是常用的建筑材料，保温和吸收性较好，但不耐酸。
多项研究发现，大、小鼠对于垫料的原材料并不是很挑剔。
Van等14用C57BLΠ6J和BA LBΠc小鼠测试了再生纸、木材、棉、毛等6种垫料，没有发现小鼠特别的嗜好那种垫料，只要是自然的、易于筑巢的，垫料的形状和结构不是很重要。Ag o等15发现小鼠喜欢柔软、易于藏身和筑巢的垫料。R o16注意到小鼠和大鼠喜欢相对大一些、不整体、粗糙的颗粒垫料，还要求反光性(transparency)低。
我国在评价、选择垫料原材料方面，首先，也应该考虑木材，要调查我国主要的木材资源的种类、木材加工现状、木材价格等，列出可能作为垫料原材料的后选树种或木材。其次，也要考虑玉米芯和植物纤维(如秸秆、蒲草、芦苇等)。再生纸因为价格因素，可能不适合中国国情。
对垫料原材料第一个要检测、评估的指标就是原材料的卫生学标准。对垫料进行卫生学检测是必要的，也应该是严格的。卫生学检测的重点是确定原材料内是否残留危害动物和人类的杀虫剂、杀菌、抑菌剂和重金属元素。这就需要调查、研究、分析这些后选原材料产区、加工部门，可能使用的农药、防腐剂、抗生素等种类、剂量、可能的残留量、可能的重金属污染等。参考国内、外相关标准，列出我国垫料中杀虫剂、杀菌剂、抑菌剂和重金属等有害物质的检测项目，规定出这些有害物质在垫料中的最大量。
国外一些大的垫料生产企业每六个月对其产品进行一次全面的卫生学检测，测定内容包括重金属元素(如，铅、汞、镉、砷、钼、铍)、杀虫剂(如,Alpha BHC、Beta BHC、Aldrin、Heptachlor E poxide、Dieldrin、Endrin、DDE、DDD、DDT、Diazinon、Ethyl Parathion、Methyl Parathion、Malathion、P olychlorinated Biphenyls2 PC B)、微生物(如，大肠杆菌、沙门菌、绿脓杆菌)、毒素等。例如，根据美国标准(US Environmental Protec2 tion Agency toxic equivalent levels)规定木材中杀虫剂林丹(lindane)残留量要小于0102ppm，重金属镉(cadmium)残留量要小于0101ppm(http:ΠΠw w w.Πntpspecifications.html)。
2.2 垫料原材料毒性分析
垫料原材料本身可能含有影响动物健康的物质，在这方面引起大家关注的是松树和雪松类木材中刺激物的毒性问题。
雪松中主要刺激物是皱酸(plicatic acid)，松树属树木(family pinaceae)中主要有害成分是松香酸
(abietic acid)。不同产地的这两类树木中，皱酸和松香酸含量也不同。如，西方红雪松(Thuja picata)中皱酸的浓度比东方白雪松(Thuja occidentalis)和日本雪松(Cryptomeria japonica)高(http:ΠΠw Πcedar.html)。研究还发现，雪松和松树类木质素(w ood lignin)的一些成分经过氧化、结构异构化后也会变成了致癌物。
皱酸和松香酸能引起人免疫介导的过敏和炎症反应、哮喘、鼻炎、结膜炎，而且这个过程是渐进的3。虽然，人们对皱酸和松香酸引起呼吸道疾病、哮喘、细胞毒性和致癌过程不是很清楚。但流行病调查清楚发现，从事与雪松和松树职业有关的人，哮喘的发病率比同行业其他人高50%，接触红雪松可能立刻发生哮喘，也可能推迟发生4。皱酸可以增加体内IgE、T细胞数量以及组胺等物质的浓度，皱酸和松香酸还能引起气管和支气管上皮细胞脱落、坏死4。
对动物的研究更多的集中在木材垫料提取物的毒性方面。
早在1967年,Vesl5就进行了垫料毒性的研究，发现软木类垫料能使小鼠3种肝微粒酶活性增加33%，睡眠时间减少。
常规培养的小鼠Hepa21细胞(hepatoma cell line,Hepa21)，对潜在的对人和环境有害的化学物质非常敏感。很多学者利用体外培养的Hepa21细胞研究了垫料提取物潜在的毒性。
T orronen等用Hepa21细胞研究了桤木(alder)和白杨(aspen)硬木类垫料、松树、松树和云杉的混合(mixture of pine and spruce)的软木类垫料的毒性，用纤维素(cellulo)作对照，发现软木类垫料提取物比硬木更能诱导产生芳基烃羧化酶(aryl hydrocarbon hydroxyla)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogena)，松树最明显，软木和桤木的细胞毒性比白杨大(白杨也有毒性)，漂白过的植物纤维素也诱导芳基烃羧化酶，但植物纤维类未发现细胞毒性6。有人用Hepa21细胞测定了南非使用的蛭石、未漂白的纸浆(unbleached pulp)、松树、桉树(eucalyptus)、玉米芯等垫料对酶的诱导性和细胞毒性。发现，玉米芯几乎没有酶诱导作用和细胞毒性，松树刨花和木材混合的锯屑酶诱导作用和细胞毒性最强。Pelkonen等用Hepa21在体外比较系统研究了非洲、亚洲、欧洲、美洲和澳大利亚实验动物垫料的细胞毒性及诱导生物转化作用，证实世界范围内使用较少的玉米芯、稻壳(rice hulls)、稻秆(straws)的提取物没有毒性，广泛使用的松树类垫料细胞毒性最高，它的提取物是潜在的细胞色素(cytochrome P4501A1)诱导者，硬木类垫料和草(grass)毒性很小7。
也有人比较系统研究了松树、云杉(spruce)、白桦(birch,)、白杨和纤维素提取物抑制四膜虫(Tetra2 hymena pyriformis)生长试验，发现所有木材材料均抑制四膜虫生长，松树抑制力最强。小鼠实验显示，松树垫料使小鼠脾PFC(plaque forming cells,PFC)数量显著提高、肝重增加。研究还发现，使用松树垫料小鼠的繁殖力比使用白杨垫料小鼠低的多。如果让小鼠自己选择，发现小鼠最喜欢白杨垫料，其次是云杉、白桦，没有一个小鼠选择松树垫料。
垫料还影响小鼠的免疫反应,San ford等用木材垫料和棉花比较研究，发现使用木材垫料的小鼠肠淋巴结内淋巴细胞数量增加，但垫料类型不影响病毒的血清抗体8。不同级别或不同种类的动物对垫料的要求可能也有差异。如，棉花垫料对正常小鼠是安全的，但可能增加裸鼠患结膜炎的机会。
在垫料的致癌性方面，也进行了许多研究。发现使用低树脂的松树(low2resin pine)垫料加上雪松刨花使C3H2Avy fB雌性小鼠平均乳腺癌发病率稍微提前。Sabine等测定东方红雪松(Juniperus virgini2 ana)对酶的诱导性和致癌性，发现红雪松不但松刺激酶产生，而且使C3H2Avy,C3H2Avy fB和C BAΠJ小鼠自发肝癌、乳腺癌的时间明显提前、发病数量增加。木材锯屑诱导小鼠肝单氧合酶(liver m onooxy2 gena)，滤纸质垫料(filter2paper bedding)可能使肝肿瘤增加。
松树和雪松类垫料来源广，价格便宜，本身含有气味，有天然杀虫作用。虽然，这类垫料的危害已经被科学界证实9，但是，包括美国国立卫生研究院(NIH)在内的许多著名研究机构还在使用松树和雪松
类垫料，其中可能有商业或经济上的原因。有些人承认松树和雪松类垫料的毒性，但认为这些垫料产生的毒性没有大到足以影响实验动物生产和动物实验结果的地步。
我们认为，分析已知的、未知的和无法控制的实验动物生产和动物实验环境中的毒性物质的作用，对于动物生产和获得可靠的动物实验结果是至关重要的。特别是在动物实验研究中，虽然采用了标准化实验设施和饲料，但由于垫料毒性和酶的诱导作用有大有小，使用同一近交系动物在不同的实验室
对同一药物或化学物质得出的毒性结果可能是不一样的。所以，我们强烈要求控制垫料的质量，减少这个动物最接近的环境因素对实验结果的干扰。
理想的木材垫料应该是本身含有的化学成分对动物无害、或带来的危害最低，引起免疫反应的可能性小。分析文献资料，结合国情，我们认为杨树应该是比较理想的木材垫料原料。杨树属树木在我国有几十种，是我国主要树种之一，资源丰富，价格也比松树和雪松类软木材低。另外玉米芯也是较好的垫料原材料，我国玉米芯资源也很丰富，玉米芯是玉米产地的副产品，当地农民把玉米芯当柴烧或者白白扔掉。另外，白桦、云杉、蒲草、芦苇和再生纸类垫料也应该继续开展研究。
研究思路：对于卫生学检测合格的垫料原材料，包括上面提到的白杨、玉米芯等国内可能作为垫料的原材料，用丙酮提取原材料内化学物质，用国际上通用的Hepa21细胞系先体外筛选出没有毒性、适合中国使用的垫料原材料，再进行动物体内实验研究。
我们也应该对国产松树和雪松类原材料的毒性进行研究，以确定这类垫料到底对动物的危害有多大。有人实验研究发现，将松树和雪松类等软木材用炉子加热到66℃，可以除去部分脂溶性化学物质，降低毒性5。我们应该继续深入系统研究，加热或其他途径除去部分脂溶性化学物质后，松树和雪松类等软木材还能不能作为垫料使用?
2.3 垫料舒适性(suitablity)和吸收性(absorbency)评价
舒适性和吸收性是评价垫料品质两个重要的指标。垫料舒适性主要靠动物对垫料的反应来判断，垫料吸收水分和氨浓度的能力通过测试就可以知道。
在评价垫料舒适性方面,Ag o等设计了一个评价方案：在不同的盒子里放不同的垫料，盒子互相相通，小鼠可自由的进入任何一个盒子，根据小鼠在某种垫料的盒子里停留和睡眠时间长短，可以推断小鼠喜欢那一种垫料15。Cunliffe等则根据小鼠的睡眠时间，判断垫料的优劣。他们研究了高压灭菌和没有灭菌的硬木、白云杉、白松和红雪松垫料对小鼠睡眠时间的影响，发现垫料灭菌与否对戊巴比妥引起的小鼠的睡眠时间没有影响。DBAΠ2J雄性小鼠在硬木、白云杉垫料中睡眠时间比在白松和红雪松垫料中明显长，在白松垫料中睡眠时间比在红雪松
垫料中明显长;C
57BLΠ6J雄性小鼠睡眠时间从长到
短依次是：硬木、白云杉、白松和红雪松垫料。研究
还发现使用红雪松和白松树垫料24h到5d后，可引
起小鼠肝脏毒性，其中，白松树肝毒性最大17。Ras
等比较了玉米芯、白杨和碎纸条垫料，发现大鼠喜欢
白杨，其次是碎纸条、玉米芯18。
通过比较研究，观察动物的摄食、繁殖及某些生
理、生化指标等，也可以反映出垫料的质量。例如,
P otgieter等对小鼠使用蛭石、松木刨花和桉树锯屑
垫料，对比研究这些垫料对小鼠生殖力(产仔数、离
乳数、增重等)的影响，作为评估垫料的指标，发现不
同的垫料对小鼠生殖力的影响是不同的。相比而
言，蛭石比松木刨花和桉树锯屑效果好19。也有人
录像记录了小鼠日常行为，观测了体重、饲料消耗、
某些器官重量、血清肾上腺素浓度等，结果发现白杨
树类垫料能提高小鼠盒子内环境的质量，是较好的
垫料。Armstrong等还发现使用不同垫料对小鼠进
攻行为有影响，如选用柔软的玉米芯和谷物壳类垫
料，可降低小鼠的好斗的行为，因为柔软的垫料容易
藏身20。
垫料除了舒适性外，对水和氨的吸收性也很重
要。当动物饲养盒子内氨浓度达到5ppm时，就开
始影响大、小鼠的呼吸系统，氨浓度超过25ppm时,
可引起大鼠肺部明显病变16。如果垫料氨吸收性
能差、盒子更换周期长，盒子底部氨浓度可达到300
ppm，严重影响动物健康16。
Ward等比较了再生报纸类垫料和小麦秸杆
(wheat straw)、干燥处理的松树刨花(kiln2dried pine2
w ood shavings)，发现报纸加工的小球(pelleted news2
paper)的密度比报纸片(phopped newspaper)和麦秆高
50倍，比刨花高15倍。碎报纸、麦秆、刨花具有可
燃性，刨花持续时间最长，报纸加工的小球不易燃
烧。报纸的吸水性>400%，麦秆>200%。报纸类
垫料重金属含量低，符合美国标准21。看来用废报
纸作为垫料材料是可行的。吴端生等测定了泡桐、
椴木和玉米芯的的吸水性，每克垫料分别吸收
3131、3142、2143g，木材垫料优于玉米芯垫料12。
动物饲养盒子内微环境的湿度和氨浓度还取决
于垫料更换周期，如果盒子内垫料更换周期短，盒子
内氨浓度和湿度肯定小，改善动物生活环境需要各
方面配合。Reeb等研究测定小鼠I VC(Individual
ventilation cage)盒子内氨浓度和相对湿度后认为,
I VC盒子内换气次数为30次Πh，成年小鼠每周应该
更换一次垫料，如果两周更换一次垫料，换气次数应
该为60次Πh，这样才能保持盒子内健康的微环境22。
文献对于动物垫料舒适性、吸收性评价的结果，与原材料毒性分析结果没有太大的出入。让动物自己选择垫料的类型，几乎所有的大、小鼠拒绝了松树和雪松类垫料，松树和雪松也影响动物的睡眠，对动物的繁殖和生理、生化代谢不利。动物对没有危害的白杨、玉米芯等安全垫料明显宠爱有佳。
在研究垫料的舒适性方面，我们也应该对于筛选出来的没有毒性的垫料原材料，加工成成品垫料，让动物自己选择垫料的类型，搞清楚那些垫料是动物真正喜欢的。同时，测定后选垫料对动物繁殖、生理和生化代谢活动的影响，测定垫料的吸收性，以期全面了解垫料的性质。
2.4 垫料加工、灭菌(sterilization)和包装
垫料的加工过程不属于本文讨论的内容。在这里只讨论垫料形状和大小(form and particle size)、粉尘(dust)、加工过程中二次污染(contaminant)、灭菌、包装、运输、保存等内容。
对于垫料颗粒的大小和形状的评价，如，木材垫料是刨花好、还是锯屑好或者混合物好，就像评价垫料的舒适性一样，应该由动物自己来选择，来评价。垫料颗粒太小，可能产生的粉尘就多，不利于动物和人的健康，颗粒太大，舒适性可能要差一些。木材垫料在加工过程中要过筛，除去木片、木条、和过小的粉末。
Blom等扫描分析了垫料颗粒大小和形状，并用超声波检测了垫料粉尘，用小鼠和大鼠对垫料的反应作
为评估标准，建议不要选用颗粒小于112mm×116mm的垫料，应该选用纤维较大颗粒的垫料23。啮齿类动物可能更喜欢柔软、容易筑巢、藏身、相对大一些、不整体、粗糙、反光性低的颗粒垫料15,16。
虽然动物对垫料原材料不是太在意，但对于垫料的形状和大小多少还是有些讲究。锯屑颗粒太小，粉尘多、动物也不喜欢，不是理想的垫料。
正确评价垫料的形状、大小对动物的影响，还需要进行深入的研究。将垫料制成形状、大小不同的规格，像研究垫料的舒适性一样，观察动物在不同规格的垫料中的停留时间，推断出动物真正喜欢什么规格的垫料，作为评价垫料大小和形状的指标。
由于各种原因，垫料在加工过程中容易受到微生物污染，所以，垫料使用前应该灭菌。但是，在世界范围内，还有很多单位使用的垫料没有灭菌处理。啮齿类动物接触垫料后，可将其携带的病原微生物通过垫料传染给实验动物。Thigpen等给肝炎病毒(m ou hepatitis virus,MH V)阴性的哨兵小鼠(ntinel mice)使用MH V阳性小鼠使用过的脏垫料，发现哨兵小鼠也感染了MH V24。已经证实通过垫料传播冠状病毒(C oronavirus)、螨和多种真菌(如,A.f u2 migatus,zygomycete,Penicillium sp,Fusarium sp,Cla2 dosporium sp.Rhodotorula sp.Cryptococcus uniguttula2 tus，和Penicillium sp.)。
对于普通级啮齿类动物使用的垫料也应该进行灭菌，没有灭菌处理的垫料是寄生虫传播的主要途径之
一。高压、高温蒸汽灭菌是垫料常用的灭菌方法，采用此法灭菌时，垫料会吸收湿气而失去吸水性，潮湿垫料也利于微生物生长，因此，对采用此法灭菌的垫料，应有足够的干燥时间及良好的储存条件。
垫料产生的粉尘粒子数的多少也是衡量垫料优劣的一个重要指标。垫料的粉尘能引发人和动物皮炎、呼吸道疾病25。为了研究垫料产生的粉尘对动物和人的影响,Thigpen等研究了标准测定垫料粉尘离子数目的办法，发现只有垫料样本的大小和垫料摇动时间(shake time)协调一致时，才能对垫料粉尘有一个公正的评价。50或100g垫料摇动30～60s 时间，不足以正确测定垫料粉尘粒子的大小和数目25。
P otgieter等比较研究蛭石、松木刨花和桉树锯屑等垫料的粉尘、吸收水分和氨的特性，使用垫料7 d后，蛭石盒子内氨浓度比桉树锯屑低，但粉尘粒子数却高出5倍，松木刨花盒子内氨浓度最高((1～3 ppm)，但比蛭石盒子内产生粉尘粒子数少50%，桉树锯屑的吸水性比蛭石和松木刨花高35%和76%26。Raynor等27测定了使用接触性垫料和金属网底的大鼠盒子内的温度、湿度、氨浓度和粉尘粒子数。研究显示，使用垫料的大鼠盒子内氨浓度比金属网底的大鼠盒子内的低，但金属网底的大鼠盒子内粉尘粒子数低。
粉尘粒子数的多少也与饲养人员的操作有关。不正确的倾倒垫料要产生大量的粉尘粒子。新技术不断应用在垫料的粉尘粒子数测定上，评估垫料质量的技术也在不断完善。现在需要做的是确定一个正确
的测定垫料粉尘的标准方法，然后利用这个方法测定常用垫料的粉尘粒子数，为建立一个量化的垫料粉尘粒子数评估体系做参考。
再谈一点垫料的包装和运输。垫料的包装应使用完全密封的、一次性包装材料，为了维持垫料品质及减少被污染的机会，垫料在运输及储存过程中均宜用垫板、架子或台车来与地面隔离。垫料要保存在干燥、凉爽、远离污染源的地方，保质期应该不超过一年。
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〔收稿日期〕2003201214
