安徽医科大学学报Ada Unwersitatis Menicinalis Anhul2070Apr；56(4)-695•
网络出版时间：2021-3-11：45网络出版地址：https[//kvskS eet/kcms/UetWW34)1045)R.72714317)022.227.htwi
◊技术与方法◊
坎地沙坦靶向TRAIL-DR6介导的AMPK信号通路减少
宫颈癌细胞自噬保护的研究
齐广涛，张丽丽，郭庆枝，王莉，李丽
摘要研究坎地沙坦靶向TRAIP-DR4介导的AMPK信号通路对宫颈癌细胞的自噬保护作用的影响。以人宫颈癌HeLa 细胞作为研究对象，测定不同浓度坎地沙坦对HeLa细胞TRAIP-TR4、AMPK、ATG2A、LC3I、LC3U.Bap.Bcl-P水平的影响。与0.2p mol/P相比，0.0、30.0、60.0p mol/P坎地沙坦处理后，Bap、TRAIP-DR4水平升高(P<0.05),B c U2、人)01、)1311/PC3I.p-AMPK水平降低(P<0.05)且呈浓度依赖性。坎地沙坦能够抑制HeLa细胞增殖，促进凋亡，可能与TRAIP-TR4介导的AMPK信号通路减轻HeLa细胞的自噬保护作用相关。
关键词坎地沙坦；靶向；凋亡诱导；死亡受体5；腺苷酸活化蛋白激酶
校园风光中图分类号R737.33
文献标志码A文章编号1000-1492(2020)04-0647-05 Uoi：10.19405/p cnkS issnl400-197)0070.04)028
近几年宫颈癌发病率居高不下，并呈年轻化趋势，患者复发率高，预后不佳^2。自噬与癌症进展相关，能诱导细胞凋亡，也能实现细胞器更新和代谢需求，进而保护细胞4]o腺苷酸活化蛋白激酶(adet nosinemonopPosuPateactivatedppteinninu,AMPK)激活可调节细胞增殖、凋亡、氧化应激，是细胞自噬途径的上游通路⑷。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体-死亡受体0(tumopecpsisfactar-relatedanopmsist mUucmgbguiU-UwthpcwWP,TRAIF-DR5)是与自噬相关的跨膜受体，能上调DR2水平进而促进癌细胞凋亡。坎地沙坦是血管紧张素U(anaiotexsin U, AjU)受体拮抗剂，临床常用于降血压、改善心肌重塑，在肿瘤增殖、侵袭、血管生成方面也发挥重要作用，可抑制宫颈癌HWa细胞增殖，但作用机制未知4]。该研究测定经坎地沙坦作用后的HWa细胞中自噬相关因子水平，以探究坎地沙坦调控HWa
2027-14-12接收
基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目(编号：2016WS0039)作者单位：滨州医学院附属医院妇科，滨州256605
作者简介：齐广涛，男，主治医师，硕士；
李丽，女，副主任医师，硕士，责任作者,E-mail:kWa72@
< 细胞自噬保护作用相关机制。
1材料与方法
14试剂与仪器坎地沙坦购自上海阿拉丁试剂有限公司，货号：C172239-1g；兔抗人TRAIL-DR5、兔抗人AMPK4兔抗人AMPK磷酸化(p-AMPK)、兔抗人自噬相关基因9A(autophayy related gededA, ATG2A)、兔抗人微管相关蛋白轻链3(micptuduie-vsociated potein light chain3,LC3)、兔抗人Bax、兔抗人Bci-P4兔抗人0-actin、兔抗人ph2一抗均购自上海熹垣生物科技有限公司，货号分别为：XY-R309304XY-70R-30353、XY-76R-S172、XY-SPC-622D-STR4XY-74R-S1503、XY-70R-33566、XY-DSC-76-565-R252、XY-CVL-PAB72985、XY-F48755；羊抗兔IgG-HRP二抗购自上海恒斐生物科技有限公司，货号:SE130；Ann ex m V-LINC/PI试剂盒购自上海科敏生物科技有限公司，货号：KA3520；iO/ght FL1702智能成像系统、Attune NxT流式细胞仪购自美国赛飞世尔科技公司。
1.2细胞人宫颈癌细胞株HeLa购自中科院上海细胞库。5%CO2、35七、98%相对湿度的恒温培养箱中培养，培养液为含有1%FBS的DMEM培养基。隔天换液,-20%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。
1.2CCK-8法测定坎地沙坦对HeLa细胞增殖的抑制作用收集对数生长期HeLa细胞，用DMEM 培养基调整细胞密度,HeLa细胞按照5x17个/孔的数量接种至96孔板中。继续常规培养过夜，弃去旧DMEM培养基，加入270p i含有不同浓度坎地沙坦(坎地沙坦终浓度分别为
2.5、5.0、12.2、22.0、49.0、82.0pnoWL)的DMEM培养基⑷，培养45h 后，弃去旧DMEM培养基，各孔加入20pi CCK-5溶液和不含FBS的12pl DMEM培养基,h后弃培养基，用酶标仪测定450nm波长处吸光度(optical de/Wty,0D)值，同时设置2.1%的DMSO对照组和空白对照组，每个浓度设置2个复孔。细胞增殖抑
・648・
安徽医科大学学报 Acta Unwersitabs MePicinalis AnhuS 202) Apr ；56(2)玻璃天堂
制率(％) =
4 - ( OD 实验组-OD 空白对照组)/( OD 对照组
-OD 空白对照组/ x 102% o 用SPSS 软件计算坎地沙 坦对HeLa 细胞的半数抑制浓度(10))。
1.3流式细胞仪测定坎地沙坦对HeLa 细胞凋亡
率的影响 收集对数生长期HeLa 细胞，用DMEM 培养基调整细胞密度，HeLa 细胞按照2.0 x 105
个/孔的数量接种至2孔板中，继续培养过夜，弃去
旧培养液，加入含有2. 2、9. 2、30. 0、60. 7 pno/L
坎地沙坦的DMEM 培养基，培养48 h 后，弃去旧 DMEM 培养基，避光条件下用FITC 和PI 标记，具体
操作按照试剂盒说明书进行，每个浓度设置6个复 孔，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.3透射电镜观察坎地沙坦处理后HeLa 细胞中
自噬体 HeLa 细胞经 2. 2、9. 0、32. 0、60. 7 p mo/L 坎地沙坦处理48 h 后，胰酶消化，用预冷的PBS 重
英雄联盟战绩在线查询悬HeLa 细胞，离心、弃上清液，用2.7%戊二醛固 定，脱水、包埋、切片，枸椽酸铅染色，透射电镜观察
HeLa 细胞中自噬体数。
1.3免疫荧光检测坎地沙坦处理后HeLa 细胞中 p62蛋白表达 HeLa 细胞以
2. 7 x 96个/孔接种至 含有细胞爬片的24孔板中，培养过夜，弃旧培养基,
加入有2. 2、9. 2、30. 0、60. 7 p mO/L 坎地沙坦的 DMEM 培养基，培养48 h 后，弃去旧DMEM 培养
剑蝶基,PBS 清洗3次，用4%多聚甲醛固定9 mi,PBS 清洗3次，通透、封闭，加入兔抗人pP2 一抗孵育过 夜，避光下加入荧光二抗,37 °C 暗室孵育3 h，滴加
DAP/37 C 暗室孵育5 mi,PBS 清洗3次，滤纸吸
干，封片，在激光共聚焦显微镜下观察。
1. 3 Westers blot 测定坎地沙坦处理后HeLa 细 胞中 TRAIL-DR5、AMPK 、ATG4A 、LC3 I 、LC3
H 、Bax 、Bcl-2蛋白水平 用RILA 液裂解不同浓度
坎地沙坦处理后的HeLa 细胞,4 C 离心提取总蛋
白，根据BCA 试剂盒说明书测定总蛋白含量。SDS-
PAGE 电泳分离目标蛋白(86 V,32 mi ； 102 V,66
mid )，转至PVDF 膜上,5% BSA 封闭，分别加入相
应兔抗人一抗(1 : 1 002)，孵育过夜，加入羊抗兔 IgG/HRP，孵育2 h,ECL 显色，测定条带灰度值，蛋
白相对含量=目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。
1.3统计学处理 使用SPSS 2
2. 7版软件对数据
进行统计和分析。数据以x±s 表示，多组比较行单 因素方差分析，任意两组相比行SNK-p 检验。P< 0005 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1坎地沙坦对HeLa 细胞增殖抑制的影响
2. 2、2. 5、5. 7、12. 0、22. 7 32. 7 30. 7 pmo/L 坎地沙
坦作用于HeLa 细胞48 h 后，增殖抑制率分别为 (2.59 ±2. 21 )%、(9.54 ± 1.06)% 3 (10.74 ± 2 75)%, (30.55 ± 4.71 )%, (45. 86 ± 5. 36、％、
(67.33 ±6. 9)% 和(86. 29 ± 0 94)% ，增殖抑制率
随浓度增加而升高，具有浓度依赖性。坎地沙坦对 HeLa 细胞的 IC )为(32.38 ± 3.74) p mo/L ，参照
IC )值，后续实验采用 2. 7、9. 232. 0、60. 2 p mo/L
坎地沙坦进行。见表 1 。
2.2 坎地沙坦对HeLa 细胞凋亡的影响 0.2、 9. 730. 7、66 p mo/L 坎地沙坦作用于HeLa 细胞 48 h 后，细胞凋亡率分别为(1. 26 ± 2. H ) %、( 4. 99
±2. 58) %、(7. 9 ±225)% 和(9. 86 ±2.05)% o
与 0.2 pmo/L 坎地沙坦相 比,9.7,30.2,66.7
p mol/L 坎地沙坦处理后,HeLa 细胞凋亡率升高(P
<0.05)，且呈浓度依赖性(P<2.05)。见图9表 2。
2.3坎地沙坦对HeLa 细胞中自噬体数目的影响0.2 p mo/L 坎地沙坦处理后，可见HeLa 细胞中
自噬体数目较多，经9.0、30.0、60.0 p mo/L 坎地 沙坦处理后，HeLa 细胞中自噬体数目减少。见图
2。
2.4坎地沙坦对p62蛋白表达的影响2.7p moO L 坎地沙坦理后，可见HeLa 细胞中p62蛋白荧光较
弱，经9.0、30.0、60.0 p mo/L 坎地沙坦处理后, HeLa 细胞中p62蛋白荧光强度增强，呈浓度依赖
性。见图 3。
表 1 HeLa 细胞中 ATG4A 、LC3 I 、LC3 H 、Bax 、BcC2 蛋白水平比较(n = 6,6±e)
坎地沙坦(p mU/L )
Bee/ p -actix
Bcl-L/p-actix LC8 II /FC8 I ATG6A/p-acUb 0.2
2. 17 ±0.04 2. 34 ±0.09
5.57 ±0.68
2.92±2.11
12.0
0.45 ±0.05
*0.21 ±0.07* 1.73 ±0.27
*0.74±0.07
*37.00.54 ±2.03
*#
0.48 ±0.22
*
#
0.75 ±0.09*
#0.55 ±0.22
*
#
60.00.74±0.10*也
2. J2±0.07*#a 0.H±0.04*#a 0.07±0.06*#a F 值
76.417
97.527
体感音乐817.098
76.623
P 值0.700
0.700
0.7000.700
与0.2 pmol/F 坎地沙坦组比较：P<2. 05；与12.0 pnol/F 坎地沙坦组比较：”<6. 05；与37.0 pmol/F 坎地沙坦组比较：△
小炒油麦菜P <2. 05
安徽医科大学学报 Adi UniersitaCs Medicinalts Anhui 2221 Apr ；56(7)・ 649 •
A q [A]FL1-FTIC/FL3I-PI
B q [A]FL1-FTIC/FL3I-PI
C , [A]FL1-FTIC/FL3I-PI
D 3 [A]FL1-FTIC/FL3I-PI
10° io 1 io 2 io 3
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囲 8134 ■:
8.93
慈母多败儿是什么意思图1不同浓度坎地沙坦对HeLa 细胞凋亡率的影响
A ：2.0 p moWL 坎地沙坦组；
B ：0.0 p moWL 坎地沙坦组;
C ：50.0 p moWL 坎地沙坦组；
D ：60.0 p moWL 坎地沙坦组
0.0 pmol/L 15.0 pmol/L 30.0 pmol/L 60.0 pmol/L
图2坎地沙坦处理后HeLa 细胞中自噬体数目比较 x 22 002
0.0 pmol/L 15.0 pmol/L 30.0 pmol/L 60.0 pmol/L
2.2 坎地沙坦处理后HeLa 细胞中ATG4A 、LC3I 、LC3 II 、Bax 、Bcl-2 蛋白水平 与 2. 2 pmol/L 坎
地沙坦相比，经1.0、30.0、66. 2 p mol/C 坎地沙坦
处理后，HeLa 细胞中B ox 蛋白水平升高(P <2. 05) ,Bci-2、ATG2A 、LC3 U /LC3 I 蛋白水平降低
(P<0.07)。见表1和图4
o
-654 -安徽医科大学学报 Acta UniversPagt MePicina/t Anhus 202) Apr;56(4)
2.6 坎地沙坦处理后HeLa 细胞中TRAIL-DR5、
p-AMPK 水平比较 与0.2 p mo/L 坎地沙坦相
比，经9.0、30.0、60.0 p mo/L 坎地沙坦处理后,
HeLa 细胞中 TRAIF-DR5 水平升高 （P<2. 05）,p-WMPK 水平降低（P < 2. 05、。见表 2
和图 5。
图 4 Western bloh 检测 HeLa 细胞中 ATG4A 、
LC3 I 、LC3H 、Bax 、Bd-2 蛋白水平
A ：0.2 p nU/F 坎地沙坦组；
B ：H.O p mol/F 坎地沙坦组；
C ：
30.0 p nU/F 坎地沙坦组；D ：60.2 p mol/F 坎地沙坦组
p-AMPK
图 6 Westers bloh 检测 HeLa 细胞中 TRAIL-DR6.
AMPK .p-AMPK 水平
A ：0.2 p nU/F 坎地沙坦组；
B ：H.O p nU/F 坎地沙坦组；
C ：
30. 7 pnU/F 坎地沙坦组；D ：62. 2 pnU/F 坎地沙坦组
表 2 HeLa 细胞中 TRAIL-DR5 S p-AMPK 水平比较(n = 6,6±e)坎地沙坦（p mU/L ）
TRAIT-NR5/0-actiu p-RMPK/AMPK
0.2
2. H ±0.05 1.04 ±2.1712.00.38 ±0.07*
2.77 ±0.09*37.00.70±0.09*# 2.44±2.06*#60.0
133 ±2. H *#A 0.12±0.05*#a
F 值125.259
128.176
P 值0.6000.600
与2. 2 p nU/F 坎地沙坦组比较：* P<2. 05；与12.0 p no/F 坎 地沙坦组比较:#P< 28 2）与39. 2 pnol/F 坎地沙坦组比较：A P<
2 .05
年新增患者近54万例，主要由人乳头瘤病毒感染诱 发，但具体发病机制尚未有统一定论。自噬因在肿
瘤发生发展中具有双重作用而备受关注，可能成为
肿瘤治疗中促进肿瘤细胞凋亡的靶点。
坎地沙坦因具有降压作用被广泛应用于临床,
后因抗癌作用而成为研究热点，但是其作用机制仍 在探究。研究⑷表明坎地沙坦可抑制Ap n 诱导的
肝癌He/G2细胞增殖。本研究显示，HeLa 细胞增
殖抑制率随坎地沙坦处理浓度的增加而升高，说明
坎地沙坦具有抑制HeLa 细胞增殖的作用。Bae 、
Bct-9分别为促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，在凋亡进程
中发挥重要作用。本研究表明，坎地沙坦处理后, HeLa 细胞中Bct-9蛋白水平降低，凋亡率及Bax 蛋
白水平升高，同样说明坎地沙坦可促进HeLa 细胞 凋亡，有望成为治疗宫颈癌的候选药物。韩燕燕J ］
研究表明，坎地沙坦可以阻断Ap I 对HeLa 细胞分
泌VEGF 的促进作用，从而影响HeLa 细胞的转移侵
袭作用，本研究将从其他途径进一步研究其作用机
制。
自噬与细胞增殖密切相关，研究3 4］表明自噬抑 制剂羟氯喹（HCQ ）可减少骨髓瘤细胞中自噬泡数 量，诱导细胞凋亡。后续研究4］显示，三结构域蛋
白21（ TRIM21 /在肝癌组织中低表达，上调其水平, 可下调肝癌细胞中自噬相关蛋白ATG4B 水平。 ATG6A 是调控自噬的关键蛋白，可通过促进自噬促
进肿瘤转移J 4］ o LC3分为（型和II 型，自噬发生过
程中，1型经加工后转化为II 型，其中LC3II 与自噬 体数量呈正向关41］。P62在自噬发生时可结合
LC3-I 蛋白形成复合物，最终在溶酶体中降解44 ］ o
本研究显示，经坎地沙坦处理后，HeLa 细胞中pP2
蛋白荧光强度较强，自噬体数减少，ATG6A s
LC3 n /LC3 I 水平降低，说明坎地沙坦可抑制HeLa
细胞发生自噬，进而促进细胞凋亡。TRAIF 与DR5
结合，进一步与半胱天冬酶DI caspaD /缔合，诱导 cuspa-9活化，随后活化caspaA 导致肿瘤细胞凋
亡44 o 研究44］表明，坎地沙坦可靶向上调TRAIF- DR5水平，从而提高TRAIF 介导的人肺腺癌细胞凋
亡的敏感性。本研究同样显示，经坎地沙坦处理后, TRAIF-DR5水平升高，说明坎地沙坦可能通过上调 TRAIF-NR5水平，抑制自噬，从而促进HeLa 细胞凋
亡。AMPK 在细胞水平上调节能量平衡，激活后可 诱导自噬，抑制癌细胞凋亡42 ］ o 此外，研究45 ］表明 坎地沙坦可下调AMPK 磷酸化水平，抑制自噬。本
研究显示，坎地沙坦处理后，HeLa 细胞中TRAIF-
3 讨论
近几年，宫颈癌的病死率和发病率居高不下,
每
安徽医科大学学报Acta U t O wo P c PU Medm Ahud205)Apr；56(4)・651•
DR5水平升高,y-AMPK水平降低，说明坎地沙坦可能上调TRAD-DR5水平从而抑制AMPK磷酸化，进而抑制自噬，促进细胞凋亡。
参考文献
[1]Hu X,Li Y,Wang F,et al.haliProsiPc indnccs cell cyclo arrest
and apopPsir in human ce/icai cancer SiNa cells[J].Biochem Biophys Ros Commun,2717,17(4)：5351-9.
[2]Wen X,Wen D,Yang Y,et al.Urdax-ural disparitu in cervical
cancer in China and feasible intemeftions Os tack/ny Pc rural ex-cevWJ].Me/iNno,2719,93(1、：—3977-O.
J]马景蕃，张燕，叶甘萍，等.千里光菲灵碱诱导MEK/ ERKl/d介导的宫颈癌细胞自噬效应[J].中国药科大学学报,2513,47(5)：516-25.
[4]Zhang J,Zhao P,Quan N,et al.Tho e/dotoxemia cerdiac dys
Onctioo is aCe/uated by AMPKmTOR signaUng patOway reaula-ting autopha/[J].Biochem Biophys Ros Commun,2517,472
(5)：525-7.
[5/刘宇平，何文雯，王文彦，等.坎地沙坦对卵巢癌Cacv-5细胞迁移和侵袭能力的影响4]肿瘤,270,33(11):5-16.
4]齐然，类成刚，白一玄，等.血管紧张素U通过AT1/RC/ ERKl/d信号通路影响HvG2细胞的增殖能力[J].中华肝脏病杂志,270,26(3)：521-6.
4]韩燕燕•血管紧张素II受体拮抗剂对宫颈癌HVa细胞VEGF 表达的影响4.中外女性健康研究,2717,14：45-5.
4]王纪珍，陈君敏，曾志勇，等.自噬调节药物对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响[J].中国实验血液学杂志,
270,26(5)：317-25.
[]李涛，陈#曦，孙梁博，等•三结构域蛋白21通过下调自噬相关蛋白4B抑制肝细胞癌细胞增殖的实验研究[J].第三军医大学学报,2719,41(9)：3O-22.
[19]Yang h W,Ping Y F,Jiang Y X,et al.ATG5A promotes tumor
mePstasis by inducing Pc epiPeVal-mepchymai transitioo and stem-likc pupeUies m yast/c cells[J].OncoP/et,2516,7
(25)：39279-92.
40Wen Z,Zhang J,Tang P,et al.Overexpression of miR-SC5indibits autopha/and apopPsir of dopamine/ic neurons by revulating Pc AMPK/mTOR signaling pathway in Parkinson S dia[J].
MW Med Rep,270,17(1)：151-7.
[14]Demishtein A,Fraiberg M,Berko D,et al.SQSTM1/p62-mVm-
pf autopha/compe/saPs Os loss of proteasomo polypniuuiUp rc-cruitiny cagaciNJ]-Autopha/,2517.15(19)：1677-773. [15]Guo X,Meng Y,hhe/g X,et al.Tunicamycin eqUances human
colon cancer cells P TRAD-induced agoptosis by JNK-EHOP-mc-diateP DR5uprevuCtPo and tho indibi/oo of Pc EGFR pathway 4]•Auicancer Duys:2717,23(1)：50-74.
[14]Zhou C,Gn J,Zhang G,et al.AMPK-auPpha/mdibitPo /si-
tizos icaU/p-mdnceP anti-colorectal cancer cell activity[J].Onco-targei,2717,3(9)：14750-47.
[15]Rashe/uzzamax M,Park h Y.AnUhypeUe/sive dua-cannesarPn
Cte/uatos TRAD resistance in human lung cancer via AMPK-mc-diateP inhibition of autopha//up[J].Exp Cell Ros,250,373
(1)：125-35.
Study on candes8rtan tarreting TRAIL-DR6-mediated AMPK sionaling patliway reduces autophagy prrtection of cervicat cancer celts
Ql Guangtao,Zhang Lili,Guo Qingzld,/al
(Depi of Gyrhcodgy dated Hospitai of Binzhoo Medical Collepc,Binzhoo256603)
Abstmec To stupp the effect cP cundesaUan taryeting TRAIL-DR5-mediated AMPK signaUng pchway on axtoph-agp p/tectiou cP ce/icui cyncvr cells.Human ce/icui cyncvr HVa cells were ud as the stupp o/jects.The lav-els of TRAIL-DR5,AMPK,ATG5A,LC3I,LC3I,Baa and Bcl-2in HVa cells were measured.Compared with0[xmol/L cvndesaUan,the agopPsis uta of HVa cel l s and Cveis of Baa and TRAD-DR5inc/asV after treatment with15.6,30.0and60.6[xmoCL cundesaUan(P<0.05),the Cveis of Bcl-2,ATG5A,LC3I//C3 I and p-AMPK dv/asV(P<0.05),in a caoce/tration Cvvdvt manner.Candesartan cun indibit HVa cells p/liferatiou and p/motv agopPsis,which map be related to TRAIL-DR5-mediated AMPK signaUng pchway re/uc-ing the cPphcy protection of HVa cells.
Key wo V s cundesartan;taryet;agopPsis inducing；death receptor5;Cvosina mouopPospnCv activated prypin kina
