实时定量PCR技术在科学应用上被誉为一门艺术。实时荧光定量PCR技术一直没有真正的实验标准，不同实验平台上得到的结果之间可能完全没有可比性。前段时间生物通推出的生物技术专题“定量PCR技术报告”系列文章受到了读者的关注。在此基础上，生物通收集编译世界各地多位Real-time PCR专家们在多年实验的经验之谈，就实时定量PCR技术中5大关键问题畅谈个人心得，希望能对您的实验有所帮助。记住，本文并不打算告诉你什么是最好的或者是正确的观点，即使专家们的看法也各有不同，本文仅仅是提供多位定量PCR老手的看法供你参考借鉴，从中取其精华结合自己的观点才是真正重要的。
Q1: What are your criteria for high-quality RNA?
Q2: What pre-amplification methods have you applied and validated?
Q3: How do you measure intra- and inter-assay variation?
Q4: What do you consider when lecting your quantification strategy?
Q5: What standards and templates do you u?
一、real time RT-qPCR技术要点之一：什么是高质量RNA标准？
real time RT-qPCR 是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PC
R张顺的性格步骤。好的开始是成功的一半，获得高质量的、能正确反应样品中转录情况的RNA，对于其后的定量结果，自然是非常重要的。
Mikael Kubista，教授, R&D TATAA Biocenter主任：
RNA质量包含两个方面：样品的纯度和RNA的完整性。样品纯度可以在样品稀释时得到改善。我们通常通过Nanodrop测量吸光值来检测纯度。 260/280吸光值的比率应该在2至2.1的范围内，并且是“漂亮”的吸光光谱曲线。230nm吸收峰应该低。我们通过利用Experion (Bio-Rad)记录电泳图（风的形成原因electropherogram）检测RNA葱油酥饼的质量。当然，最理想的结果是得到很清晰的18S和28S峰值。但RNA的完整性是无法改善的，保存样品、固定样品和来源于富含降解酶的器官的样品RNA完整性通常不好。检测RNA质量的两个原因，一是想要知道某一个实验得到的 RNA质量，从而选择适当的RT-qPCR方法，二是识别出研究中的样品的质量是否比正常情况差，避免导致偏差或者不正确的结果。
Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心
高质量的RNA应该是完整的、不含抑制剂的。我们习惯利用毛细管凝胶电泳系统来评价28S和 18S条带的比率，过程很快速并且只需要很少量的RNA。值得注意的是，这个比率
是组织或者细胞特异的，所以理想的是你应该将样品与一个同样细胞来源的完整对照比较。在芯片分析（微阵列研究）中通常都要求进行RNA质量分析，现在许多定量PCR领域的人们开始考虑RNA质量这个因素。我们最近在发表的文章说到评价用于PCR分析的RNA的质量尤为重要，这是由于并非每个基因降解水平都相同，严重时甚至可以使你的实验结果出错(Perrez-Novo et al., 2005)。我们主要的结论是：参考基因(reference gene)的稳定性在完整样品（intact）和在降解样品中是有差别的，因此你不应该将完整的样品和降解的样品相比，尤其是你在研究精确的表达差异时。
检测核糖体吸收峰值是目前评价RNA完整性的金标准，但其实rRNA仅是mRNA机关食堂管理制度成分完整性的一个代言标记。我们开发了一种基于PCR的分析实验，可以比较一个特定基因的5'和 3' 端amplicons的比率。通过比较未知样品和完整的对照样品的比率，我们能够利用PCR分析实验衡量mRNA的完整性，与电泳评估/rRNA评估相比更具有直接相关性。
为了评价制备RNA的纯度（例如没有抑制剂），我们实行qPCR SPUD分析，既简单易用又免费(Nolan et al., Anal Biochem, in press).
Tim Hunter，英国伦敦大学学院（UCL）：
你需要建立灵活的操作流程来分离高质量的RNA。样品类型决定着哪一种分离方法是最好的。通常，初步的质量监控检查是在NanoDrop 分光光度计进行核酸定量的时候，260吸收峰外的读数值可指示污染情况。260/280的比率应该在1.8 至2.1的范围内。同样非常关键的，是要保证实验所用的RNA质量（全长、完整性）不打折扣，因此，我们通常利用Agilent 2100 Bioanalyzer检查RNA的完整性，并根据rRNA峰值的完整性判断RNA样本的情况，选择下一步实验适合的方法。假如有证据显示重要样品有降解，我们会同时检测一个在该样品中已知稳定的管家基因，来观察是否出现由于转录产物不完整而导致管家基因在这个样本中的表达改变。当探针并非处于外显子— 外显子边界时，我们会同时选择中/高表达的管家基因作(-)RT对照，以检查基因组DNA的污染情况。样品可在37ºC下孵育2-4小时，并重新在 Bioanalyze上分析降解情况，以检查核酸酶的活性。
Cristina Hartshorn,美国Brandeis大学生物学系：
我认为高质量RNA是指正确代表细胞内容物的转录池（transcript pool）的RNA。我们实验室非常注重RNA的回收率，尤其是来源于像单个细胞等的微量样品中RNA的纯化，需要尽量减少可能导致核酸降解的操作步骤。因此，我们开发了一种能在同一支试管里连续
进行收集细胞、裂解细胞、去除蛋白杂质、逆转录和实时定量PCR等操作的整体流程。这种整个实验在单个试管内进行的方法称为PurAmp (Hartshorn et al., 2005a; Hartshornet al., 2005b)，该方法基于稀释法，并且不需要将RNA结合到任何纯化基质上去，因此保证了实质上纯化得到完整的RNA库。此外，我们觉得转录产物的完全去蛋白化对于RT引物与模板的正确结合、以及最终模版定量的精确性和可重复性来说是十分必要的，这就像对基因组DNA模板制备来说是必需的一样。
PurAmp方法有时要求一个DNa消化的步骤，但是我比较喜欢避免这一步。我尝试过多种DNa操作方法，但结果总是发现回收的RNA比预期的少。这可能是因为最后一步高温失活酶的步骤导致了RNA的水解。一些商品化的手册表明经过“+ / - DNa”处理后的实时PCR循环，特定样品的信号会出现几个循环的Ct漂移（shift）。其实，考虑到每个细胞中特定的基因的拷贝数比该基因表达时的转录产物的拷贝数少得多，这种漂移几乎是难以察觉的，因此，不应该在DNa消化后稀释模板数量。我喜欢一起扩增DNA和RNA模板，最后消减去基因组DNA的拷贝数（详细请见Question 5）。
Jim Huggett，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
我们在英国的实验室通常利用Agilent Bioanalyzer评估核糖体RNA条带来评估纯化RNA的质量。然而，由于我们在撒哈拉以南的非洲国家开展许多研究工作，这里仪器缺乏，所以我们要用琼脂糖凝胶电泳来评价rRNA，从而告诉我们核糖体RNA条带是否OK，以及我们的RNA提取工作是否有效；然而，越来越多证据表明，这些rRNA条带的降解不一定意味着mRNA降解。用什么方法进行质量评估是个人的喜好，现有的评估方法还是必需的。
Xiuling Zhang,纽约州卫生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center:
对于从人类组织中分离的RNA样品来说，我的高质量RNA标准是：
1． rRNA 比率 [28s/18s] ≥ 1. 1, RNA完整系数 (RIN)≥ 7 (利用Bioanalyzer 2100进行分析)
2. 28s和 18s 生产造句条带明显(变性琼脂糖凝胶电泳)
3. 比率 [260nm/280nm] ≥ 2.0 (分光光度计测量).
实时定量PCR技术要领之二：你选择哪种有效的预扩增方法？
Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
目前，对于低丰度目标样品或者低回收率的核酸，我们不需要使用预扩增（pre-amplification）步骤来产生足够的起始材料。我们在逆转录反应中设计的一种特殊的引物策略通常能解决目标样品的低表达问题。目前市场上已经有几种系统能很好地解决样品的低表达问题，但确证预扩增步骤不会在实验分析中产生偏差，对于实验是非常之关键的。
Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：笔记本摄像头打不开
我们参与[NuGen公司的] Ovation mRNA扩增技术的多实验室验证，以及手忙脚乱类似的成语[ABI公司的] TaqMan PreAmpMaster Mix Kit（用于在qPCR前预扩增cDNA）的Beta 测试。两个产品我们用起来都不错。我们用后一种产品来研究单个细胞内多种基因的表达。所有扩增子的引物都加入样品中，浓度远低于常规PCR，进行14个循环的预扩增后停止反应，反应产物被稀释并用作第二次PCR反应的模板，第二次PCR每个反应使用单对引物和探针。一次可以平行预扩增多达100种目的基因。最直接检测预扩增效果的方法，是选择一些浓度较高的样品，同时平行地进行预扩增和直接扩增，从而比较多个基因的表达模式（比率）是否得以保留。我们同样也利用一种高表达基因，如18s作为预扩增的内参（internal control）。
Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
我们评估了几种全转录组（whole-transcriptome）扩增方法，包括基于T7 RNA聚合酶的线性RNA扩增方法和基于PCR的指数扩增方法。我们最重要的质量指标，是扩增前后样品之间的基因表达比率的一致性，倒不是基因之间的一致性。由于不同转录产物的扩增效率不同，多数扩增方法都会带入由此而引起的偏差（这种偏差通常是可重复的），这就意味着你不能简单地在预扩增后比较基因的表达水平——就算不进行预扩增，而采用直接扩增，这种比较本来也是困难的，可能有偏差的）。幸好，好的试剂盒或多或少能够保持样品之间表达率的一致性，这正是目前我们最关心的东西。除了全基因组/全转录组预扩增方法外，最近出现的其他方法，首先对一组挑选出来的基因进行循环次数有限的预扩增步骤，紧接着稀释产物并对每个目标进行单基因检测。对于已知预定目标基因的研究来说，这些方法显得更适合。
定量PCR操作要点之三：怎么衡量inter-assay和intra-assay间的差异？
荧光实时定量PCR的所谓“定量”需要借助已知拷贝数的参照进行比较，或者比较不同目标之间的信号进行相对定量，这种比较的前提是各目标的反应条件的一致性，对于灵敏度
如此之高的反应来说，两个样本之间反应条件的毫厘之差就可能影响结果。事实上，不同批次、不同反应管之间都很难做到天冷就回来“所有”反应条件完全一致，比如各成分的浓度，比如仪器的系统误差如96孔板加热的边缘效应、逐个孔读数（PMT）的时间积分问题或者是CCD读数的光程差距和干扰问题等等，都可能导致inter-assay（批间）和intra-assay（批内）间的差异。不同实验平台上得出的数据之间没有可比性、可重复性。如何评估这个差异呢？
Cristina Hartshorn，美Brandeis大学生物学：
LATE（Linear-After-The-Exponential，指数后线性扩增PCR技术是由Brandeis大学Wangh发明的一种不对称 PCR新技术）PCR技术的发展为我们提供了更灵敏的新工具来监控实时定量PCR实验中的inter-assay和intra-assay的差异。 LATE-PCR能高效地产生单链的扩增子（amplicons），很有优势(Sanchez et al.,2004; Pierce et al., 2005)。
我们近期的基因表达研究采用了LATE-PCR技术。线性扩增使得我能够同时检测单个细胞的多个转录本，哪怕这些转录产物的量差别很大。在传统的对称双重 PCR（duplex PCR）中，高丰度的转录本（模版数多）具有扩增优势，很快荧光信号达到了平台期，这
时PCR反应物池中的成分可能在某种程度上已经大量消耗，因此可能降低了第二个转录本，或者说低丰度模板扩增的效率。相反，在实时LATE-PCR分析中，所有的扩增子线性累积，并且所有的荧光信号具有一个不变的斜率，直到反应终止，不会达到平台期。这种策略保证了不同丰度的多种mRNAs的共同扩增和可靠定量。
我发现实时LATE-PCR过程中荧光信号连线的斜率（slopes）对监控intra-assay的差异极为灵敏，因为它们会受到反应中的很细微差别的影响而变化，而这中细微的变化在对称PCR中是无法觉察的。这对我的工作很有帮助，因为我在同一试管里通过稀释来进行细胞裂解、反转录和PCR。我觉得考查LATE-PCR和RT PCR联合使用的这些特点是非常有意义的，因为这使得最终定量基因表达成为可能。
