【论著】
一种化学与植物消毒液消毒相关性能研究
陈艳华，陈贵秋，李世康，高 琼，宋江南，易 亮，张莹莹
（湖南省疾病预防控制中心，湖南长沙 ４１０００５）
摘要 目的 研究一种化学与植物提取物消毒液消毒相关性能，为消毒应用提供科学依据。方法 采用理化分析和定量杀菌试验及动物试验方法，对该消毒液的消毒相关性能进行试验观察。结果 该消毒液以植物提取物与丙醇类组成，原液ｐＨ为８ ２５。以该消毒液原液作用０ ５ｍｉｎ对悬液内金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的杀灭对数值均＞５ ００；对白色念珠菌的杀灭对数值＞４ ００。用该消毒液原液对手和皮肤擦拭消毒作用１ ０ｍｉｎ，对自然菌的杀灭对数值均＞１ ０。该消毒液急性经口毒性ＬＤ５０值＞５０００ｍｇ／ｋｇ（体重）；完整皮肤和黏膜以及破损皮肤刺激性试验评分均为０；小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验为阴性；亚急性经口毒性试验对大鼠最大未观察到有害作用的剂量为１０００ｍｇ／ｋｇ·ｂｗ。结论 该消毒液对细菌繁殖体和真菌具有快速杀灭效果，属实际无毒级物质，无致突变作用，对皮肤黏膜均无刺激性。
关键词 化学消毒液；植物提取物；正丙醇；消毒效果；毒性
中图分类号：Ｒ１８７ １ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－７６５８（２０１５）０３－０２２８－０４
Ｓｔｕｄｙｏｎｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｐｌａｎｔｅｘｔｒａｃｔｓｂａｓｅｄｄｉｓ
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Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｓｔｕｄｙｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｐｌａｎｔｅｘｔｒａｃｔｓｂａｓｅｄｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｂａｓｉｓｆｏｒｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｈｙｓｉｃａｌａ
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〔基金项目〕 湖南省科技厅资助项目（２０１４Ｗｋ３０２７）
〔作者简介〕 陈艳华（１９７４－），男，湖南永州人，大学本科，主管医
夜夜骑日日射
师，从事卫生监测检验技术工作。
〔通讯作者〕 陈贵秋：Ｅｍａｉｌ：９５０２１０＠ｖｉｐ ｓｉｎａ ｃｏｍ
为探寻新型安全的皮肤消毒剂，本研究以植物提取物为杀菌成分，辅以少量丙醇类组成成分，研制出一种复方消毒液。该复方消毒液经初步研究证明
其性能基本符合设计要求，为全面评价该消毒剂实际应用的可能性，进行了杀菌效果、理化性能以及安全性实验室和现场试验研究。现将研究结果报告如下。
１ 材料与方法１ １ 试验材料
·８２２·ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２０１５；３２（３）网络出版时间：2015-03-04 16:30
网络出版地址：wwwki/kcms/detail/11.2672.R.20150304.1630.010.html
试验用消毒剂（无锡优洁科技有限公司提供）含植物提取物７ ２３ｇ／Ｌ，正丙醇含量为体积分数０ ４５％，辅以体积分数７ ２％的丙二醇，组成无色透明溶液，原液ｐＨ值为８ ２５。
试验菌用金黄色葡萄球菌（ＡＴＣＣ６５３８）、大肠杆菌（８０９９）、铜绿假单胞菌（ＡＴＣＣ１５４４２）和白色念珠菌（ＡＴＣＣ１０２３１），均由军事医学科学院消毒检测中心提供。
１ ２ 理化性能试验
按ＧＢ／Ｔ１０３４５－２００７《白酒分析方法》规定的方法检测正丙醇，按《中华人民共和国药典》２０１０版二部方法检测丙二醇；按企业标准Ｑ／３２０２ＹＪ０１５－２０１３方法植物提取液成分，以蒸馏水作为空白对照。植物提取物分析方法具体操作步骤是，用溶剂定容，用紫外分光光度计在２６０ｎｍ处测定样品的吸收值，使吸光度值处在０ ２～０ ８ＡＢＳ。如果高于此吸光度０ ８，则适当稀释（稀释倍数ｆ），如果低于吸光度０ ２则适度增加样品重量。样品含量计算公式：Ｘ（ｇ／Ｌ）＝０ ２４２９×Ａ×ｆ，检测植物提取液含量；稳定性试验将样品置３７℃温箱９０ｄ检测样品的有效成分含量。
１ ３ 杀菌试验
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１ ３ １ 菌悬液制备 取各试验菌纯化分离的单个典型菌落接种营养琼脂培养基斜面（白色念珠菌用沙堡培养基），于３７℃温箱培养２４ｈ，取其新鲜培养物分别用胰蛋白胨生理盐水（ＴＰＳ）洗下菌苔，混合均匀制备成菌悬液，用ＴＳＢ营养肉汤将菌悬液稀释至所需浓度。
１ ３ ２ 中和剂鉴定试验 以白色念珠菌和金黄色葡萄球菌为代表，试验设平行６组，按照悬液定量杀菌试验程序进行中和剂鉴定试验。结果，第１组无菌生长或有少量菌，第２组长菌数比第１组多但比第３、４、５组少（第１、２为０时，将消毒剂和中和剂１∶４稀释再做１、２组试验），第３、４、５组的组间误差率不超过１５％，第６组无菌生长，所选中和剂及其浓度适宜。
１ ３ ３ 悬液定量杀菌试验 试验消毒液和菌悬液均在２０℃恒温控制器预温５ｍｉｎ，并保持在此条件下进行试验。分别取４ ０ｍｌ该消毒液（阳性对照用ＴＳＰ）入无菌试管内，加入１ ０ｍｌ菌悬液，作用至预定时间后，取０ ５ｍｌ菌药混悬液加入到装有４ ５ｍｌ中和剂试管内。充分混匀并中和作用１０ｍｉｎ，取样液接种培养，进行活菌计数，计算平均杀灭对数值。试验至少重复３次。
１ ３ ４ 现场消毒试验 ①手和皮肤现场消毒试验：选择工作人员为受试者，在受试者一侧手指屈侧和前臂内侧皮肤上，用无菌棉拭沾湿采样液作涂抹采样，为消毒前对照。然后在另一侧手及相同部位皮肤上用该消毒液原液擦拭消毒１ｍｉｎ，按上述方法作消毒后采样作为消毒后试验组。将采样棉拭头无菌剪入装有１０ｍｌ中和剂的试管内，经充分震荡洗脱，取洗脱液接种培养，进行活菌计数，计算平均杀灭对数值。试验重复３０人份。②物体表面现场消毒试验：以木质物体表面作为消毒对象，在５ｃｍ×５ｃｍ标示面积上用无菌棉拭子沾湿采样液作涂抹采样为对照组。然后在相邻部位用不同浓度试验消毒液作擦拭消毒，作用１０ｍｉｎ后用相同方法作消毒后采样，为试验组。将采样棉
拭子头无菌剪入装有１０ｍｌ中和剂的试管内，按上述方法进行活菌计数培养。同样重复３０份。
１ ４ 毒性试验方法
１ ４ １ 急性经口毒性试验 采用霍恩氏法。选择体重１８ ０～２２ ０ｇＳＰＦ级昆明种小鼠４０只，随机分为４组，每组１０只，雌雄各半（长沙天勤生物技术有限公司提供的ＳＰＦ级昆明种，试验动物生产许可证号为ＳＣＸＫ（湘）２００９－００１２，下同）。试验期间温度２２℃～２４℃，湿度５０％～５４％，试验前动物禁食１６ｈ。设剂量为４６４０、２１５０、１０００、４６４ｍｇ／ｋｇ（体重）等４组，用无菌蒸馏水配制受试液。采用一次性经口灌胃给药，灌胃体积为０ ２ｍｌ／１０ｇ（体重），灌胃后连续观察１４ｄ，记录中毒表现及死亡情况，计算ＬＤ
５０
值。
１ ４ ２ 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 取体重２５～３０ｇＳＰＦ级昆明种小鼠雌雄各５０只，随机分为５组，每组１０只，雌雄各半（动物来源同上）。设计剂量为雄鼠５４０、２１６、５４ｍｇ／ｋｇ（体重），雌鼠分别为７３５、２９４、７３ ５ｍｇ／ｋｇ（体重）；以４０ｍｇ／ｋｇ（体重）环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照。受试物用无菌蒸馏水溶解配制，采用经口灌胃
３０ｈ染毒法。按照间隔２４ｈ灌胃两次，每次灌胃体积为０ ２ｍｌ／１０ｇ。末次给药后６ｈ颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Ｇｉｅｍｓａ染色。在光学显微镜下，每只动物计数１０００个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，计算微核率（以千分率计）；计数２００个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比例（ＰＣＥ／ＮＣＥ）。采用ＳＰＳＳ软件统计分析。
１ ４ ３ 急性眼刺激试验 取该消毒液原液０ １ｍｌ，滴入家兔左侧眼结膜囊内，另一侧眼以灭菌生理盐水作为对照。滴受试物后，将眼被动闭合４ｓ，３０ｓ后用灭菌生理盐水冲洗。于滴眼后不同时间肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。如
预防火灾安全知识·
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果７２ｈ内未出现刺激反应，或第７ｄ或第１４ｄ眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。
１ ４ ４ 阴道黏膜刺激试验 选择体重２ ０～２ ５ｋｇ健康白色雌性家兔６只（来源同上），分为染毒组和对照组，每组３只。将长度为８ｃｍ左右的钝头软管与２ｍｌ注射器连接，注满受试液备用，每只动物准备一套。将动物仰面固定，暴露会阴和阴道口，将导管用受试液或生理盐水湿润后轻柔地插入阴道４～５ｃｍ，并用注射器缓慢注入２ｍｌ受试液，抽出导管，完成染毒。对照组动物用灭菌生理盐水作同样处理。染毒后２４ｈ，采用气栓法处死动物，剖腹取出完整的阴道，纵向切开，肉眼观察是否有充血、水肿等表现。然后将阴道放入１０％福尔马林溶液中固定２４ｈ以上，选取阴道两端和中央３个部位的组织制片，ＨＥ染色后，进行组织病理学检查。
１ ４ ５ 多次完整皮肤刺激试 选择体重２ ０～２ ５ｋｇ健康白色家兔３只（来源同上），试验前２４ｈ将白色家兔背部脊柱两侧的毛剪掉，去毛范围左、右各约３ｃｍ×３ｃｍ。次日，将受试物（该消毒液原液）０ ５ｍｌ均匀涂抹于一侧去毛皮肤表面，另一侧去毛皮肤作为空白对照。涂抹４ｈ，用蒸馏水清除残留受试物，每天涂抹一次，连续涂抹１４ｄ，必要时剪毛，不损伤皮肤。在每次涂抹后２４ｈ观察结果。
１ ４ ６ 一次性破损皮肤刺激试验 选择体重２ ０～２ ５ｋｇ健康白色家兔３只（来源同上），试验前２４ｈ将家兔背部脊柱两侧的毛剪掉，去毛范围左、右各约３ｃｍ×３ｃｍ。次日，先用７５％
酒精擦拭消毒去毛部位皮肤，用注射针头在皮区内划一个“井”形的破损伤口，将０ ５ｍｌ受试样品滴于破损部位皮肤上覆盖的４层纱布上，然后用一层油纸覆盖，再用无刺激性胶布固定。另一侧去毛破损皮肤用等量灭菌蒸馏水作为对照，与前作同样处理。敷用４ｈ后，用蒸馏水除去残留受试物，分别于去除受试物后１、２４、４８ｈ，观察皮肤局部反应。
１ ４ ７ 亚急性经口毒性试验 取ＳＤ种雌、雄大鼠各２０只，随机分为４组，每组１０只，雌雄各半（动物来源同上）。分别设置１０００ｍｇ／ｋｇ·ｂｗ、２００ｍｇ／ｋｇ·ｂｗ、４０ｍｇ／ｋｇ·ｂｗ等剂量组和对照组。采用灌胃给药，对照组予以等体积的蒸馏水，每天一次，灌胃体积为１ ０ｍｌ／１００ｇ·ｂｗ，连续２８ｄ。各组动物均喂以普通饲料，自由摄食饮水。每天观察动物的活动表现及中毒症状，每周称一次体重。试验末期，禁食１６ｈ采血。每只大鼠摘眼球采集两份血，抗凝管全血用雅培ＣＤ３７００全自动血球计数仪测定血红蛋白（Ｈｂ）、红细胞压积（ＨＣＴ），进行红细胞（ＲＢＣ）、白细胞（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）计数及ＷＢＣ分类；非抗凝管血分离血清后用ＯＬＹＭＰＵＳＡＵ４００全自动生化分析仪测定总蛋白（ＴＰ）、白蛋白（ＡＬＢ）、肌酐（Ｃｒ）、尿素氮（ＢＵＮ）、谷丙转氨酶（ＡＬＴ）、谷草转氨酶（ＡＳＴ）、胆固醇（ＣＨＯＬ）、甘油三酯（ＴＧ）和血糖（ＧＬＵ）。颈椎脱臼处死动物作大体解剖检查，称肝、肾、脾、心、脑、肺、睾丸、卵巢重量，计算脏／体比值，取心、肺、肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸、卵巢、脑、肾上腺作病理切片检查。
２ 结果
２ １ 理化性能试验结果
绿化效果图该消毒液原液密封包装置３７℃温箱９０ｄ后，其正丙醇含量下降率为８ ８９％，丙二醇含量下降率为１ ３８％，植物提取液含量下降率为２ ２１％。
２ ２ 中和剂鉴定试验结果
试验结果证明，用含３０ｇ／Ｌ吐温－８０、３０００ｍｇ／Ｌ卵磷脂和１０００ｍｇ／Ｌ皂素的ＰＢＳ，作为中和剂，可有效中和该消毒液原液对金黄葡萄球菌和白色念珠菌残留作用，符合中和剂的要求（表１）。
表１ 复方消毒液中和剂试验结果
组序
各菌平均回收菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）
金黄色葡萄球菌白色念珠菌１００
２２０２１３４００
３１９９００００１７６００００
４１７９００００１６７００００
５２１０００００１８０００００
６００
２ ３ 杀菌试验结果
结果表明，以该消毒液原液作用０ ５ｍｉｎ对悬液内金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的杀灭对数值均＞５ ０，对白色念珠菌的杀灭对数值均＞４ ０（表２）。
２ ４ 现场消毒试验结果
经３０次现场消毒试验表明，用该消毒液原液对受试者手擦拭消毒作用１ｍｉｎ，对手上的自然菌杀灭对数值均＞１ ０，平均杀灭对数值为１ ４９；用该消毒液原液对受试者前臂皮肤擦拭消毒作用１ ０ｍｉｎ，对皮肤上自然菌杀灭对数值均＞１ ０，平均杀灭对数值为２ ６８；用该消毒液原液对木质表面消毒作用１０ｍｉｎ，对自然菌杀灭对数值＞１ ０，平均杀灭对数值为１ ９５。
２ ５ 毒性试验结果
２ ５ １ 急性经口毒性和微核试验结果 该消毒液
对昆明种雌、雄小鼠的急性经口ＬＤ
５０
值均大于
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０
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５０００ｍｇ／ｋｇ·ｂｗ，属实际无毒级物质。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验各剂量组微核率与阴
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性对照组比较差异无显著性，而与阳性对照组比较差异有显著性（Ｐ＜０ ０１）。因此，该消毒液小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴性。
表２ 消毒液杀菌效果
试验菌试验
序号
作用不同时间（ｍｉｎ）
平均杀灭对数值
０ ５１ ０１ ５
阳性对照组
菌数对数值
白色念珠菌１６ ０６６ ０６６ ０６６ ０６
２６ １０６ １０６ １０６ １０
３６ １３６ １３６ １３６ １３
金黄色葡萄球菌１７ ２１７ ２１７ ２１７ ２１
２７ ３１７ ３１７ ３１７ ３１
３７ ２８７ ２８７ ２８７ ２８
铜绿假单胞菌１７ １９７ １９７ １９７ １９
２７ ２４７ ２４７ ２４７ ２４
３７ ２９７ ２９７ ２９７ ２９
大肠杆菌１７ ２６７ ２６７ ２６７ ２６
２７ ４１７ ４１７ ４１７ ４１
３７ ０８７ ０８７ ０８７ ０８
２ ５ ２ 皮肤黏膜刺激性试验结果 急性眼刺激试验结果显示，该消毒液染毒后１ｈ，有３只家兔
染毒侧眼结膜血管充血并轻微水肿，角膜和虹膜无损伤；７２ｈ内眼刺激反应完全消失，１周终止试验。阴道黏膜刺激试验结果也说明，该消毒液原液对白色家兔阴道黏膜刺激试验的刺激指数为０分，属无刺激性。皮肤刺激性试验结果表明，该消毒液原液对家兔完整皮肤多次刺激试验平均积分（刺激指数）为０分，判定为无刺激性；对家兔破损皮肤一次性刺激试验最高积分均值为０分，判定为无刺激性。
２ ５ ３ 亚急性经口毒性试验结果 以３个剂量组该消毒液给大鼠经口灌胃２８ｄ，试验期间各组动物体重、增重、脏器重量及脏器／体重比值与对照组比较无显著性差异（Ｐ ０ ０５）。各剂量对大鼠的血常规、血生化各项指标未见明显影响。动物作大体解剖，未发现明显病变。病理切片检查结果未见与样品有关的病理改变。因此，该消毒液亚急性经口毒性试验对雌、雄ＳＤ大鼠最大未观察到有害作用的剂量为１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）。
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３ 讨论
本研究表明，该复方消毒液性能稳定，能快速杀灭细菌繁殖体和白色念珠菌，现场试验结果说明其对人体表面和物体表面自然菌杀灭效果也比较好。动物试验结果表明，该复方消毒液属实际无毒，对皮肤（含破损皮肤）和黏膜无刺激，小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴性，该消毒液亚急性经口毒性试验对雌雄ＳＤ大鼠最大未观察到有害作用的剂量为１０００ｍｇ／ｋｇ·ｂｗ。
关于丙二醇、正丙醇和其他醇类消毒剂制成的复方的消毒剂比较多见〔２－６〕，而正丙醇、丙二醇与植物提取液配方制剂的研究报道较少见。本研究复方消毒液主要杀菌成分为植物提取物，辅以少量正丙醇，除满足快速杀菌作用需要之外，对确保其安全性起到重要作用。从实验室的杀菌效果、现场试验、理化性能和毒性都满足同类消毒剂的水平，基本实现了性能稳定、无毒、对皮肤黏膜无刺激的设计要求，探索可用于皮肤黏膜消毒。
参考文献名侦探柯南的结局
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（收稿日期：２０１４－１０－１５）
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