1985年多大•基础研究•
3xTg-AD小鼠海马突触可塑性
与钙离子跨膜流动特征
李奕颖1原丽2闫旭东1武美娜1
1山西医科大学生理学系，细胞生理学教育部重点实验室，太原 030001 ;2山西长治
医学院生理教研室，长治 046000
通信作者：武美娜，Email: wmna@ 163. com
【摘要】目的观察3xTg-A D小鼠海马突触可塑性与钙离子跨膜流动特征。方法根据基因
型不同，将6月龄小鼠分为APP/P S l/t a u三转基因AD(3xTg-A D)模型小鼠和野生型（WT)对照组小
鼠两组，每组13只。每组随机选取6只小鼠进行在体电生理记录，给予测试刺激记录其海马CA1区
场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)、配对脉冲刺激记录双脉冲易化
(paired-pul facilitation，P P F)、高频刺激（high frequency stimulation,H FS)诱导长时程增强（long-term
potentiation，LTP)。每组剩余的 7 只小鼠采用非损伤微测技术（non-invasive micro-test technology,
陋T)，检测海马CA1区脑片神经元的跨膜钙内流和钙外排情况。3xTg-A D小鼠在电生理和NM T实
验中各损失1只，最终人组电生理实验5只,NM T实验6只。采用SPSS 18.0对所有数据进行统计学
分析，两组间比较使用两独立样本f检验。结果（1)在体电生理实验中，给予测试刺激后30 min
内，3xTg-A D小鼠和W T小鼠的fE P S P斜率均比较稳定，其平均fE P SP斜率分别为[(97. 8±2. 3)%]和
[(92. 6± 12.6) %]，两组之间差异无统计学意义（0.9105)；给予配对脉冲刺激后,3xTg-A D小
鼠和W T小鼠的P P F值分别为（1.58±0. 69)和（1.74±0. 17)，两组间差异无统计学意义（t=0. 50,P>
0.05)；给予 HFS后 30 min和60 m in,3xTg-AD小鼠的 LTP值分别为[(104. 9±丨0. 9)%]和[(98. 0士
10.8)%]，明显低于 WT小鼠的[(156. 5±21. 3)%] (j=4. 43，P<0. 01)和[(162. 5± 19.7)%] (« =
5.92,P<0. 01)。（2)在NM T实验中，3xTg-A D小鼠海马CA1区神经元谷氨酸诱导的标准化跨膜Ca2+
内流平均流速和峰值流速分别为[(-2 I66.0±425. 0)%]和[(-3 539. 6±1 270. 9)%]，远高于W T小
鼠的[(-735.3±262_9)%](i=6. 81 ,P<0_ 01)和[(-917. 3±271.7)%]《t=4_ 89,P<0. 01)；而低钙溶液
引起的3xTg-A D小鼠标准化Ca2+外排平均流速和峰值流速分别为[(1 451.6±297.1)%]和[(1968.7
±227.3)%]，显著低于 WT对照组小鼠的[(2 579. 3±810. 9)%]:..(t=2. 92,P<0. 05)和[(3 420.4±
954.8)%](*=3.31，P<0.01)。结论6月龄3xTg-A D小鼠出现的海马突触可塑性损伤可能与钙内
流增加和钙外排减少所导致的海马神经元胞内Ca2+超载密切相关。
【关键词】阿尔茨海默病；3xTg-A D小鼠；长时程增强；非损伤微测技术；钙离子
基金项目：山西省优秀青年基金项目（201801D211005)；山西省回国留学人员科研资助项目
(2020-083)；山西省研究生教育创新项目（2019SY236)
D0I ： 10. 3760/cm a. j. cn371468-20200614-01475
Synaptic plasticity and characteristics of calcium ion transmembrane flux in hippocampus of
3xTg-AD mice
Li Yiying1, Yuan Li2, Yan Xudong1, Wu Meina1
'Department of Physiology ^ Key Laboratory of Cellular Physiology, Ministry of Education ^Shanxi Medical Uni
versity, Taiyuan 030001, China；2Department of Physiology^ Changzhi Medical Collegey Changzhi 046000,
China
Corresponding author :Wu Meina，Email:************
【Abstract】Objective To obrve the synaptic plasticity and characteristics of transmembrane calci
um flux in the hippocampus of 3xTg-AD mice. Methods According to different genotypes ,6-month-old mice
were divided into two groups ：A P P/P S l/ta u triple transgenic AD (3xT g-A D) model mice and wild type
(WT) mice,with 13 mice in each group. Six mice were randomly lected from each group to do in vivo elec-
trophysiological recording. Field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) was evoked by test stimulation, paired-pul facilitation (P P F) was induced by two stimuli,and long-term potentiation ( LTP) was induced by high frequency stimulation ( HFS) in the hippocampal CA1 region of mice. The remaining ven mice in each group were ud to detect the transmembrane calcium influx and efflux in the slices of hippocampal CA1 region by using non-invasive micro-test technology ( NMT) •In the electrophysiological and NMT experiments, one mou fell off respectively. Finally,five mice were enrolled in the electrophysiological experiment and six in the NMT experiment. SPSS 18. 0 was ud for statistical analysis of all data,and two independent sample t-test was ud for comparison between the two groups. Results ( 1) In the in vivo electrophysiological experiments, the fEPSP slopes of 3xTg-AD mice and WT mice evoked by test stimulation were stable within 30 m in，and the average fEPSP slopes were ( (97. 8±2. 3)%) and ((92. 6± 12. 6)%) Respectively. There was no statistical difference of the average fEPSP slopes between the two groups (t=0.91 ,P>0. 05). After
paired-pul stimulation, the PPF values of 3xTg-AD mice and WT mice were ( 1. 58±0. 69) and (1.74±0. 17) respectively, and there was no statistical difference between the two groups (i = 0. 50, P> 0. 05). At 30 min and 60 min post-HFS,the LTP values in 3xTg-AD mice were ((104. 9± 10. 9)%)and ((98. 0± 10. 8)%) respectively，which were significantly lower than tho in WT m ice( ( 156. 5±21. 3)%，/= 4. 43 ,P<0. 01 ； (162. 5 ± 19. 7) % ,i= 5. 92, P<0. 01). (2)In NMT experiments, the standardized mean and peak velocities of glutamate-induced Ca^ influx in hippocampal CA1 region of 3xTg-AD mice were ((-2166. 0±425. 0)%) and (( -3 539. 6±1 270. 9)%) respectively,which were significantly higher than tho in WT m ic e((-735_3±262. 9)%，f=6. 81，P<0. 01;(-917. 3±271. 7)%J=4.89，P<0. 01). The standardized average and peak velocities of low Ca2+solution-induced Ca2+efflux in 3xTg-AD mice were ((1451.6±297. 1)%) and ((17±227. 3)%) respectively，which were significantly lower than tho in WT m ic e(( 2 579. 3±810. 9)%，/= 2. 92, P<0. 05; ( 3 420_ 4±954. 8)%“= 3. 31，尸<0• 01 )•Conclusion The hippocampal synaptic plasticity impairment obrved in 6-month-old 3xTg-AD may be cloly related with the intracellular Ca2+overload caud by incread calcium influx and decread calcium efflux.
[Key words] Alzheimer's dia; 3xTg-AD m ice；Long-term potentiation；Non-invasive micro-test technique；Ca"+
Fund programs: Shanxi Province Science Foundation for Excellent Young Scholars (201801D211005) ； Rearch Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (2020-083) ；The Graduate Students Outstanding Innovation Project Foundation of Shanxi Province (2019SY236) DOI：10. 3760/cm a. j. cn371468-20200614-01475
阿尔茨海默病（Alzheimer's dia,AD)是一■种不可逆的进行性神经退行性疾病。目前，全世界的 痴呆患者约有5 000万人，其中2/3以上为A D患者[1]。在中国，截至2016年底65岁及以上老年人 口占总人口的10. 8%，粗略估计A D患者人数近千 万，其患病率呈逐渐上升趋势，患者总数居世界首 位[2_3]。A D的主要临床表现为学习记忆能力损伤 和认知功能减退[4]，学习记忆的分子基础则与响应 电活动而进行的神经元突触修饰即突触可塑性密切 相关[5]。突触可塑性的重要表现形式之一是长时 程增强（long-term potentiation，LTP)[6-7]，海马 LTP 被认为与学习记忆的形成和认知行为表现密切相 关，是公认的学习记忆的电生理模型[8]。三转基因 AD模型小鼠（triple-transgenic AD model，3xTg-AD)于2003年建立，包含PS1M146V、A PPsw e和tauP301L三种基因突变，可以先后表现出老年斑和 神经纤维原缠结两种典型的病理特征，且能很好的 模拟整个病程随年龄发展的过程，是研究A D重要 的动物模型之一[9]。以往的研究已证实，3xTg-AD 小鼠在6月龄时出现恐惧记忆[1°]和空间学习记忆 能力损伤[⑴，但是缺乏对于该月龄3xTg-AD小鼠在 体突触可塑性变化特征及机制的研究。同时，LTP 的诱导和维持与突触前膜谷氨酸释放增加导致的突 触后膜NMDA受体激活和胞内Ca2+浓度增高
密切 相关[U]。然而，如果细胞外谷氨酸浓度过高或其受 体功能异常，经由谷氨酸受体通道大量流人的Ca2+可导致神经元胞内钙超载，进而损害细胞功能，引起 突触可塑性损伤[13]。但是在3xTg-AD小鼠早期，其 海马神经元胞内钙超载过程中跨膜钙离子流动发生 何种改变尚不清楚。本研究以6月龄3xTg-AD小鼠 为研究对象，首先通过电生理记录的方法观察3xTg-AD小鼠在体海马L T P的变化特点，其次使用 近年新发展的以非损伤的方式直接获取离子跨膜静 流速的非损伤微测技术（non-invasive micro-test technology,NMT)实时监测小鼠海马脑片C A1区的 Ca2+内流和外排情况，探究3xTg-AD小鼠神经元跨 膜Ca2+流动的改变，从而揭示A D早期突触可塑性 变化特征及其与跨膜Ca 2+流动变化的关系。年终奖个税税率表
材料与方法
一、 材料明天幼稚集团
1. 实验动物：本研究以6月龄S P F级的雌性 APP/PSl/tau三转基因A D模型（3xTg-AD)小鼠及
其野生型（wild type,WT)背景鼠C57B6/129为研究
对象，每组13只。3xTg-A D小鼠购买自美国Jackson Lab(健康证明编号：1711A12740)，并在山穿搭网
短的反义词西医科大学实验动物中心词养繁殖。C57B6/129小
鼠为 C57BL/6JNifdc 和 129S2 /SvPasCrl 两种小鼠
(北京维通利华公司，动物合格证编号:SCXK(京）2016-0006)杂交而来的第一代子代。所有动物均在
12 h/12 h明暗交替的SPF级动物房中饲养，自由摄食
饮水，室温保持在20~24 t，湿度为50%〜60%。
2. 主要仪器设备：程控刺激器（Master-9，以色 列AM PI公司）、多通道生物信号采集处理系统
(RM6240BD，中国成都仪器厂）、隔离器（ISO-Flex,
以色列AMPI公司）、非损伤微测系统（NMT 100 Series，美国 YOUNGER公司 ） 、Ca2+玻璃流速微传感器
[中（4. 5 ± 0. 5 )jxm，XY-CGQ-01，XY-SJ-Ca，美国 YOUNGER公司]、垂直振动切片机（VF700，美国 PRECISIONARY公司）、露点渗透压仪（VAPR0 5520，美国WESC0R E公司）、微电极用电极固定架 (EHB-1，美国 WPI公司）、PH计（PH400，上海 ALA-
LIS公司）等。主要试剂包括:Ca2+液态离子交换剂 (NMT-HC-07，美国YOUNGER公司）、L-谷氨酸（美
国Sigma公司）、非损伤微测系统定标相关试剂（北
京旭月公司）。
二、 方法
1.在体电生理记录：每组随机选取6只小鼠，使
用5%水合氯醛（8 m l/kg)麻醉后固定在脑立体定位
仪上，颅骨钻孔，将刺激电极与记录电极平行绑定，
在前囟后2.0 mm，旁开1.5 mm处插入脑中，深度
到达海马区。给予测试刺激（0.033 Hz)稳定记录
30 min的场兴奋性突触后电位（£161£)6\〇丨13〖〇17卩〇515-ynaptic potential，fEPSP)，然后给予3串配对脉冲刺
激（串间隔30 s，刺激间隔50 ms)记录配对刺激引
起的两个fEPSP，并计算双脉冲易化（paired-pul facilitation，PPF)值（即 fEPSP2/fE P S P l)a 最后给予
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3 串高频刺激（high frequency stimulation,HFS)(串
间隔30 s，每串20个200 H z刺激）诱导LTP，并继
续给予测试刺激至少记录fEPSP 60 minD以HFS
前30 min记录的fEPSP斜率均数为100%，将所有
记录的fEPSP进行标准化，以斜率百分比表示。2•非损伤微测技术（non-invasive micro-test tech
nology，NMT)测 定神经 元跨膜 Ca2+流 ：每组 随机选 取7只小鼠，使用5%水合氯醛（8 m l/kg)麻醉后固 定在手术台上，暴露心脏，使用4 t并经95% 02和 5%C02混合气体饱和的切片液进行心脏灌注。灌 注完成后迅速断头取脑，将脑组织浸于预冷的切片 液中30 s，切除小脑及前三分之一大脑后固定在垂 直振动切片机上，在经混合气体饱和的4 T切片 液[14]中以200 p m的厚度切片。
按照本实验室前期建立的实验方法[141，分别使 用CaCl2浓度为3 m m ol/L和0.3 m m ol/L的人工脑 脊液（artificial cerebrospinal fluid,aCSF)作为测试Ca2+微传感器的校正液，获得电压/浓度校正曲线，
当曲线斜率达到（29±3) mV/decade后开始实验(注:mV/decade为通过Nerst方程计算的斜率的标 准写法，其中钙离子的标准斜率为29 mV/decade，含义为理想情况下当溶液中钙离子浓度差10倍时，测出的电位差为29 mV)。脑片孵育1h后，将Ca2+微传感器定位到海马CA1区锥体细胞层上方约50 (xm处，并以30 jjim的两点固定距离在Z轴方向 往复移动，测定Ca2+跨膜流动的方向和流速。首先 稳定记录脑片在正常aCSF(2. 5 mmol/L Ca2+)中的 基础状态1min，然后向正常aC SF中加入终浓度为 10 mmol/L的谷氧酸（Glutamate，Glu)并记录 Ca2+内流情况5 min，或将正常a C S F置换为低Ca2+ (0. 35 mmol/L Ca2+)aCSF，并记录Ca2+外排情况5 min。通过imFluxes V2.0软件（北京旭月公司）直 接读取并输出Ca2+流速数据，正值代表外排，负值代 表内流。为方便比较,NMT的所有实验结果均以稳 定的基础状态均值（100%)为基准做标准化处理。
3.统计学处理：实验过程中，3xTg-A D小鼠在电 生理和NMT实验中各损失1只，最终入组电生理实 验5只，NMT实验6只。使用SPSS 18.0统计分析 软件对所有数据进行分析处理，实验数据为计量资 料，符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间比 较使用两独立样本《检验，P<〇.05表示差异有统计 学意义，所有图均使用SigmaPlot 10. 0绘制。
结 果
一、两组小鼠海马CA1区LTP水平比较
实验结果显示，在给予测试刺激后30 m in内，3xTg-AD小鼠（《=5)和WT小鼠（n=6)的 fEPSP 斜 率均比较稳定，其平均fE P SP斜率分别为（97. 8±2.3)%和（92. 6± 12. 6)%，两组之间差异无统计学
3xTg-AD
3xTg-AD
Post-HFS(min)
V
与
W T 组比较,a P<〇.〇l;WT：野生型鼠；
3xT g-A D ：三转基因AD 鼠;H FS ：高频刺激
图1两组小鼠海马CA1区LTP 水平比较（A ：两组小鼠 在给予HFS 前后90 min 记录过程中fEPSP 斜率的散点图; B：两组小鼠的PPF 值统计图；C: HFS 前和HFS 后0 min、30 min 和60 min 两组小鼠fEPSP 斜率直方图；D ：两组小鼠的 代表性JEPSP 原始轨迹图，实线1和虚线2分别为HFS 前 和HFS 后60 min 的代表性fEPSP 原始轨迹图。）
意义（0. 91，P>0. 05 )。在给予配对脉
冲刺
激后，
两组小鼠的P P F 值分别为（1. 58±0. 69)和（1. 74± 〇. 17)，组间差异无统计学意义（G 0. 50,P >0. 05)。 在稳定记录基础®P S P 30 min 后给予HFS,3xTg- A D 小鼠和W T 小鼠的fE P S P 斜率立刻上升到 (158. 0±23. 3)%和（145. 9±11. 5)%，两组小鼠均成 功诱导出LTP 。此后，3xTg-AD 小鼠的fEPSP 斜率 逐渐降低，在HFS 后30 min 时LTP 值降至（104. 9± 10.9)%，明显低于\^小鼠的（156.5±21.3)%(«=4. 43, P <0. 01 )♦在 HFS 后 60 min ，其代表性 fEPSP 原始轨迹如图I D 所示，3xTg-AD 小鼠的L T P 值为 (98. 0±10. 8)%，同样明显低于W T 小鼠的（162. 5±19.7) %(«=5.92，户<0.01)。见图 1。
二、
两组小鼠海马CA1区神经元谷氨酸诱导跨
膜Ca 2+内流水平比较
在基础状态下，两组小鼠的海马CA 1区神经元 均未记录到明显的Ca 2+跨膜流动。加入终浓度为 10 m m ol /L 的谷氨酸后,3xTg-AD 小鼠（n =6)及WT 小鼠U =7)海马C A 1区均可检测到快速内向的 Ca 2+流，且随着记录时间延长Ca 2+内流流速逐渐降 低，至5 min 左右WT 组小鼠恢复到接近基础状态。 同时，3xTg-AD 小鼠和W T 小鼠的标准化平均Ca 2+ 内流速度分别为（-2 166. 0±425. 0)%和（-735. 3± 262. 9)%，两组之间的差异具有统计学意义=6. 81 '<0• 001)。对两组小鼠Ca 2+内流的峰值流速 进行比较发现，3xTg-AD 小鼠和W T 小鼠的峰值流 速分别为（-3 539_ 6± 1 270. 9)% 和（-917. 3±271.7) %，二者之间的差异具有统计学意义= 4. 89，P <0. 01)。见图 2。
三、
两组小鼠海马CA 1区神经元跨膜Ca 2+外排
水平比较
在记录1 min 的基础状态后，将正常aCSF 置换 为低Ca 2+ aC SF 溶液，并记录5 min 。结果显示， 3xTg -A D 小鼠及其WT 对照小鼠海马CA 1区均可检 测到快速外向的Ca 2+流，且随着记录时间延长Ca 2+ 外排流速逐渐降低。3xTg -A D 小鼠U = 6)和WT 小 鼠U =6)的标准化Ca 2+外排速度分别为（】451. 6± 297. 1)%和(2 579. 3±810. 9)%，两组小鼠之间的标 准化净Ca 2+外排速度差异具有统计学意义（《 = 2.92,P <0.05)。同时，两组小鼠的Ca 2+外排峰值流 速分别为（1 968. 7 ± 227. 3 )% 和
（3 420. 4 ± 954. 8)%，二者之间的差异具有统计学意义〇 = 3.31，P <0_01)。见图 3S
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时间（m in )
与W T 组比较，SP<0.01;
WT：野生型鼠;3xTg-AD：三转基因A D 鼠;Glu ：谷氨酸
图
2 两组小鼠海马C A 1区神经元谷氨酸诱导的跨膜
Ca2+内流水平比较（A ：两组小鼠海马脑片C A 1区标准化 Ca2+内流速度散点图；B ：两组小鼠的平均Ca 2+内流速度直 方图;C ：两组小鼠的峰值Ca2+内流速度直方图）
讨 论
AD 是一种不可逆的进行性神经退行性疾病， 主要表现为学习记忆能力下降和认知损伤。以往研
究发现,14月龄3xTg -A D 小鼠出现参考记忆和工作 记忆损伤，同时出现代表突触可塑性损伤的LT P 压 抑[15]，本课题组前期研究也发现9月龄3xTg -A D 小 鼠出现明显的空间学习记忆能力损伤和L T P 压 抑[16]，但目前缺乏更早期3xTg -AD 小鼠在体突触可 塑性变化特征的相关报道。本研究记录了6月龄 3xTg -AD 小鼠的在体海马CA 1区LTP ，发现虽然可 以成功诱导出LTP ，但其1E P S P 斜率逐渐降低，HFS
与W T 组比较//><0. 05;
W T ：野生型鼠;3x T g -A D ：三转基因A D 鼠
图
3
两组小鼠海马C A 1区神经元的跨膜Ca 2+外排水平
比较（A ：两组小鼠在低Ca2+溶液中海马C A 1区Ca 2+外排 标准化流速散点图；B ：两组小鼠在低Ca2+溶液中平均Ca>外排流速直方图;C ：两组小鼠在低Ca2+溶液中峰值Ca 2+外 排流速直方图）
后30 m in 时已接近基础水平，出现了明显的突触可 塑性损伤。该结果与以往报道的3xTg -A D 小鼠在3 月龄时离体脑片NMDA 受体依赖型L T P 出现降低， 8月龄时NMDA 受体依赖型L T P 以及非NMDA 受 体依赖型LT P 的显著降低[|7：相一致，表明3xTg-AD 小鼠海马突触可塑性损伤在早期即可出现，且突触
可塑性损伤可能是近期报道的6月龄3xTg -A D 小鼠 出现空间学习记忆能力损伤的重要原因。
大量研究表明，神经元胞内钙浓度的变化与突
3000 •
2000.
3xTg-AD
5000 4000 • 3000
2000- 1000-
O WT • 3xTg-AD
4000 n
2000-1000-
低 C a 2+
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时间（m in )
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