钙／钙调蛋白依赖的蛋白激酶激酶2在前列腺癌及癌旁组织中的表达及其临床意义
汤永峰;符浩;付欣;蔡志煅;李博伟;叶剑恒;吴永定;钟惟德;韩兆冬
【摘 要】目的：研究CAMKK2在前列腺癌及癌旁组织中的表达，分析其表达与临床病理数据的关系。方法通过实时荧光定量PCR技术检测CAMKK2的mRNA水平在前列腺癌及癌旁组织中的表达情况，通过免疫印迹及免疫组化技术检测CAMKK2的蛋白水平在两种组织中的表达，分析CAMKK2的表达水平与前列腺癌相关临床病理特征及预后的关系。结果前列腺癌组织中的CAMKK2在mRNA及蛋白水平上均较癌旁组织中上调表达， CAMKK2的表达与血清PSA水平、是否转移及是否生化复发有关，CAMKK2的表达高低与无生化复发生存率相关，CAM KK2是生化复发的独立危险预测因素。结论 CAM KK2在前列腺癌组织中的表达增加，可能提示患者的预后情况，并可作为前列腺癌新的生物标记物。%Objective To investigate the expression and significances of CAMKK2 in prostate cancer and adjacent non‐cancerous tissues ,and analyze the associations of the expression of CAMKK2 and the clinical pathological fea‐tures .Method Q‐PCR was ud to detect the CAMKK2 mRNA level in prostate cancer and adjacent non‐cancerous tissues ,western blot(WB)and immunohisto
chemistry(IHC)were ud to detect the CAMKK2 protein level ,the asso‐ciations of CAMKK2 expression with prostate cancer clinical pathological features and prognosis were analyzed .Re‐sult The mRNA and protein level of CAMKK2 were upregulated in prostate cancer tissues than in adjacent non‐can‐cerous tissues ,the expression of CAMKK2 had relation with rum PSA level ,metastasis and PSA failure ,the ex‐pression of CAMKK2 had relation with biochemical non‐recurrence survival ,and it might be an independent predictor of biochemical recurrence in prostate cancer .Conclusion The upregulation of CAMKK2 in prostate cancer may predict the prognosis of prostate cancer patient ,and it may be a new biomarker of prostate cancer .
【期刊名称】《贵州医药》
【年(卷),期】2015(000)008
【总页数】4页(P694-697)
【关键词】前列腺癌;钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶激酶2;实时荧光定量PCR;免疫组化;免疫印迹
【作 者】汤永峰;符浩;付欣;蔡志煅;李博伟;叶剑恒;吴永定;钟惟德;韩兆冬
【作者单位】广州市花都区新华社区卫生服务中心泌尿外科，广东广州510800;南华大学附属南华医院泌尿外科，湖南衡阳 421002; 广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科/广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室，广东广州510180;广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科/广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室，广东广州510180;广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科/广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室，广东广州510180;广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科/广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室，广东广州510180;广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科/广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室，广东广州510180;广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科/广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室，广东广州510180;广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科/广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室，广东广州510180;广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科/广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室，广东广州510180
【正文语种】淋漓尽致的近义词中 文
愣次定律
【中图分类】R-33;R737.25
脑神经口诀
郑州自驾游前列腺癌（prostate cancerPCa是世界范围内男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，同时也是肿瘤相关死亡率较高的几种疾病之一［1］。随着前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）及其它筛查方法的应用愈加广泛，PCa的早期诊断率逐步提高［2］。但越来越多的证据也显示，即便不同患者具有相同的血清PSA水平、Gleason评分、病理分期等临床指标，其临床表现及预后也呈现多样化，提示在肿瘤的发生发展过程中存在各种不同的机制［3］。因此，对PCa而言，寻找更有效、更具诊断及预后价值的生物标记物，有着重要意义。钙／钙调蛋白依赖的蛋白激酶激酶2（calcium／calmodulindependent protein kina kina 2，CAMKK2）是丝／苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，主要功能是通过磷酸化调节其下游激酶CaMK1和CaMK4，从而激活或失活相关蛋白；另外它还可以磷酸化AMPK，并参与多种疾病的发生发展过程［4］。本研究通过QPCR、WB、免疫组化等多种方法检测CAMKK2在PCa及癌旁良性组织中的表达情况，并通过临床病理分析，探索CAMKK2在PCa发生发展过程中的作用。
1 材料与方法
中国冬奥会奖牌
1.1 样本来源
本实验样本来源于2011—2013年广州市第一人民医院泌尿外科行PCa根治性切除术或经尿道前列腺电切术所切下的均由病理诊断证实的标本，其中PCa 10例，均为原发PCa，配对的癌旁组织10例。标本置于液氮速冻保存。所有患者在手术前未经放疗或化疗。进行免疫组化实验的组织样本来源于广州市第一人民医院病理科，其中PCa标本45例，癌旁组织标本25例。研究CAMKK2与PCa病理特征的关系及生存曲线分析应用的材料来源于Taylor数据库［5］。该数据库包括150例PCa组织及29例非癌组织。
1.2 实验方法西洋参的禁忌人群
1.2.1 实时荧光定量PCR（QPCR） 运用 QPCR方法测定PCa及癌旁组织中CAMKK2的基因表达量。CAMKK2的上游引物（5’－3’）为 CGGTCGCAAGCTGTCTCTG，下 游 引 物 （5’－3’）为GCGTCCGTTCATGTCCAGG；β－actin的上游引物（5’－3’）为 AGCGAGCATCCCCCAAAGTT；下 游引物（5’－3’）为 GGGCACGAAGGCTCATCATT；荧光定量PCR，使用Takara Taq HS试剂，仪器为荧光定量PCR仪RotorGene 2000（Corbett公司），荧光定量PCR分析软件为Rotor－genev5。
1.2.2 免疫印迹（Western Blot） 20例冰冻样本经研钵研磨至粉状，用RIPA裂解液裂解、提取组织蛋白，绘制标准曲线，用Bradford法测蛋白浓度。取40μg蛋白用于SDS－PAGE电泳，转膜至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭，用CAMKK2抗体（1∶1 000，abcam）于4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000）室温孵育1h，ECL试剂盒曝光检测条带强度。
1.2.3 免疫组化 所有样本经4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋，4μm 连续切片，贴于经3－氨丙基－3－乙氧基甲硅烷（APES）处理的载玻片，按SP法试剂盒要求进行免疫组化染色，DAB试剂显色，苏木素复染胞核。一抗为anti－CAMKK2（1∶500）。根据阳性细胞在视野中细胞总数的百分比例及阳性细胞的染色强度作为判定标准。染色强度的评分标准为：无染色为0分，弱为1分，中等为2分，强为3分；阳性细胞比例的评分标准为：0%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，＞50%为3分。两者评分相加作为染色结果（IRS）的总体评分。
1.3 统计学分析
正态分布的计量资料以s表示，使用SPSS 17.0软件进行数据统计，采用配对t检验、独立样本t检验、Kaplan－Meier检验及Cox回归分析。P＜0.05表明差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 CAMKK2在PCa组织中mRNA表达的差异
在10对PCa组织及配对的癌旁组织中，提取总RNA，并检测CAMKK2的mRNA水平的变化，结果显示，CAMKK2在PCa和癌旁组织中的mRNA表达差异具有统计学意义（上调倍数2.08，P＜0.001），说明CAMKK2的mRNA水平在前列腺癌组织中表达上调。
2.2 CAMKK2在PCa组织中蛋白表达的差异
Western Blot检测结果显示，PCa组织中CAMKK2蛋白的相对表达量为（4.18±0.44），癌旁组织为（2.55±0.26），两者间的差异具有统计学意义（上调倍数平均为1.66倍，P＝0.001），说明CAMKK2的蛋白水平在PCa组织中表达上调。免疫组化实验进一步说明CAMKK2在PCa及癌旁组织中的表达情况。由图1可见，在PCa细胞中以中到强阳性染色为主，评分平均为（4.42±0.94），在癌旁组织中以弱阳性或阴性染色为主，评分平均为（2.60±1.23），在肿瘤组织的表达高于癌旁良性组织，差异具有统计学意义（P＜0.001）。
图1 CAMKK2在癌旁良性组织（A＆B）及PCa组织（C＆D）中的免疫组化表达情况（A＆C×20／B＆D×40）
2.3 CAMKK2与PCa临床特征的关系
通过Taylor数据库探索CAMKK2与PCa相关的临床特征的关系，发现CAMKK2的表达与血清PSA水平（P＝0.007）、是否转移（P＝0.006）、是否生化复发（P＝0.012）有关，而与年龄、Gleason评分、临床分期、病理分期等因素无关。见表1。
表1 CAMKK2的表达与临床病理特征的关系?
2.4 CAMKK2在PCa中的生化复发和生存曲线统计
