植物提取物对SGLT2和URAT1的抑制作⽤报告（1）植物提取物对URAT1和SGLT2的抑制作⽤筛选研究
研究负责⼈签字：⽇期：
2014年3⽉17⽇天津市新药安全评价研究中⼼
⽬录
摘要 (4)
1.课题名称 (4)
2.研究机构 (4)
3.委托机构 (4)
4.研究期间 (4)
5.课题负责⼈ (5)
6.课题研究参与⼈员 (5)
7. 最终报告 (5)
解释的英文
8.研究⽬的 (6)
9.材料与⽅法 (6)
9.1.测试化合物 (6)
9.2.待测化合物溶液的准备 (7)
9.2.1 DE降糖植物提取物A1的配制 (7)
9.2.2 DE降糖植物提取物B1的配制 (7)
9.2.3 DE降糖植物提取物C1的配制 (7)
9.2.4 FAM1号的配制 (7)
9.2.5 FAM2号的配制 (8)
9.3.检测系统 (8)
9.3.1.材料 (8)
9.3.2.实验步骤1), 2) (9)
9.4.结果分析 (10)
9.4.1.抑制作⽤ (10)
9.4.2.统计学⽅法 (10)
10.结果 (10)
11结论 (11)
12.参考⽂献 (12)
Table 1. DE降糖植物提取物A1、B1、C1对葡萄糖转运体（SGLT2）介导的14C-Gluco 转运活性的影响 (13) Table 2. FSM1号、FSM2号对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID转运活性的影响 (14)
Fig. 1. DE降糖植物提取物A1、B1、C1对葡萄糖转运体（SGLT2）介导的14C-Gluco 转运活性影响
的柱形图 (15) Fig. 2. FSM1号对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID转运活性影响的柱形图。 (16)
Fig. 3. DE降糖植物提取物B2对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID转运活性影响的柱形图。 (17)
Fig.4. FAM1号对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID转运活性影响⾮线性回归曲线 (18)
摘要
本研究的⽬的是评价DE降糖植物提取物A1、B1、C1 对葡萄糖转运体（SGLT2）的抑制作⽤以及FSM1号、FSM2号对⼈尿酸转运体(hURAT1)的抑制作⽤。测定A1、B1、C1（药物浓度分别为0.1，0.3，1mg/mL）对放射性标记探针底物（14C-Gluco）摄⼊活性的影响，测定A2、B2（药物浓度分别为0.03，0.1，0.3，1，3，10mg/mL）对放射性标记探针底物
（14C-URIC ACID）摄⼊活性的影响，计算50%摄⼊活性抑制作⽤浓度（IC50）。试验结果显⽰，A1、B1、C1对SGLT2的转运活性均有抑制作⽤，其中A1的IC50为2.14mg/mL，B1的IC50为0.27mg/mL，C1的IC50为0.97mg/mL；FSW1号对hURAT1的转运活性有抑制作⽤，IC50为2.50mg/mL，FSW2号对hURAT1的转运活性基本没有抑制作⽤，IC50﹥10mg/mL。
1. 课题名称
植物提取物URAT1和SGLT2的抑制作⽤筛选研究
2. 研究机构
天津药物研究院
天津市新药安全评价研究中⼼
释药技术与药代动⼒学国家重点实验室
天津市南开区鞍⼭西道308号，邮编300193
3. 委托机构
天津纳图⽣物科技有限公司
天津市和平区云琅新居A-1-1202
4. 研究期间
2014年2-3⽉
5. 课题负责⼈
慈⼩燕
6. 课题研究参与⼈员
慈⼩燕
伊秀林
李亚卓
7. 最终报告
最终报告的结果包括⽂本和图表。
8. 研究⽬的
本研究的⽬的是评价DE降糖植物提取物A1、B1、C1 对葡萄糖转运体（SGLT2）的抑制作⽤以及FAM
1号、FAM2号对⼈尿酸转运体(hURAT1)的抑制作⽤。研究中使⽤了稳定表达hURAT1药物转运体基因和SGLT2药物转运体基因的HEK293细胞系。通过A1、B1、C1在不同浓度下对SGLT2细胞介导的放射性标记探针底物14C-Gluco转运活性的影响，考察药物对SGLT2转运体的抑制作⽤；FSM1号、FSM2号在不同浓度条件下对hURAT1细胞介导的放射性标记探针底物14C-Uric acid转运活性的影响，考察药物对hURAT1转运体的抑制作⽤。
9. 材料与⽅法
9.1. 测试化合物
削弱的反义词名称：DE降糖植物提取物A1
⽣产批号：20140115-1
提供商：天津纳图⽣物科技有限公司
保存条件：4o C
名称：DE降糖植物提取物B1
⽣产批号：20140115-2
提供商：天津纳图⽣物科技有限公司
保存条件：4o C
名称：DE降糖植物提取物C1
⽣产批号：20140215-4
提供商：天津纳图⽣物科技有限公司
保存条件：4o C祝福词
名称：FAM1号
⽣产批号：20140115-3
提供商：天津纳图⽣物科技有限公司
保存条件：4o C
中队委竞选演讲稿八镜台名称：FAM2号
空字组词
⽣产批号：20140304-5
提供商：天津纳图⽣物科技有限公司
保存条件：4o C
9.2. 待测化合物溶液的准备
9.2.1 DE降糖植物提取物A1的配制
⾸先，将称量（BS 124 S，Sartorius）的中药A1 100.3mg溶解在5mL DPBS中，涡旋1min、超声10min，10000rpm离⼼
5min，得到浓度为20mg/mL 的母液。然后⽤DPBS稀释母液，分别⾄最终浓度含有2，6，20 mg/mL 的A1。
9.2.2 DE降糖植物提取物B1的配制
⾸先，将称量（BS 124 S，Sartorius）的中药B1 10.2mg溶解在5mL DPBS 中，涡旋1min、超声10min，10000rpm离⼼
5min，得到浓度为2mg/mL 的母液。然后⽤DPBS稀释母液，分别⾄最终浓度含有0.2，0.6，2mg/mL 的B1。
9.2.3 DE降糖植物提取物C1的配制
⾸先，将称量（BS 124 S，Sartorius）的中药C1 10.1mg溶解在5mL DPBS 中，涡旋1min、超声10min，10000rpm离⼼
5min，得到浓度为2mg/mL 的母液。然后⽤DPBS稀释母液，分别⾄最终浓度含有0.2，0.6，2mg/mL 的B1。
9.2.4 FSM1号的配制
⾸先，将称量（BS 124 S，Sartorius）的FAM1号81.1mg溶解在4055µL DPBS中，涡旋1min、超声10min，10000rpm离⼼5min，得到浓度为20mg/mL 的母液。然后⽤DPBS稀释母液，分别⾄最终浓度含有0.06，0.2，0.6，2，6，20 mg/mL的FSM1。
9.2.5 FSM2号的配制
⾸先，将称量（BS 124 S，Sartorius）的FAM2号81.3mg溶解在4065µL DPBS中，涡旋1min、超声1
0min，10000rpm离⼼5min，得到浓度为20mg/mL 的母液。然后⽤DPBS稀释母液，分别⾄最终浓度含有0.06，0.2，0.6，2，6，20 mg/mL的FSM2。
9.3. 检测系统
9.3.1. 材料
a. ⼈药物转运体URAT1基因稳定表达HEK293细胞：Human Embryonic Kidney 293 cells（HEK293细胞）是源于组织培养中⽣长的⼈胚胎肾细胞的特定细胞系。以插⼊了⼈药物转运体URAT1基因的哺乳类动物表
达pcDNA3.1载体转染该细胞，并以geneticin筛选耐性细胞，进⽽获得
细胞膜表⾯尿酸转运体稳定⾼表达的细胞株。
b. ⼈药物转运体SGLT2基因稳定表达HEK293细胞：以插⼊了⼈药物转运体SGLT2基因的哺乳类动物表达pcDNA3.1载体转染该细胞，并以geneticin筛选耐性细胞，进⽽获得细胞膜表⾯SGLT2稳定⾼表达的细胞株。
c. 培养基
春宵一刻
含有10%胎⽜⾎清（Lot No.1227693, Invitrogen’s Gibco）的⾼糖DMEM 培养基（Lot No.NYM1045, Hyclone）⽤于本研究的细胞培养。
d. 胰酶
0.25% Trypsin-EDTA（1×）（Lot No.1155732, Invitrogen’s Gibco）
e. 放射性标记探针底物
Uric acid, [8-14C]- (Lot No. 742-107-0578-B-20121130-SBA, Moravek) Gluco D, [14C（U）]- (Lot No. 120319, ARC)
f. 缓冲溶液
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS (Lot No. 070M8306, Sigma-Aldrich)
9.3.2. 实验步骤1), 2)
a. HEK293单层细胞培养
胰酶消化后，药物转运体URAT1基因表达细胞和药物转运体SGLT2基
因表达细胞接种于赖氨酸包被24孔培养盘（Lot No. 20130801，CHI SCIENTIFIC），细胞接种密度为105 cells/well，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养2天。
b. 放射性标记探针底物浓度
制备浓度为60µM的Uric acid, [8-14C]-，然后与待测化合物等体积混合，使其最终浓度为30µM。
制备浓度为60µM的Gluco D, [14C（U）]，然后与待测化合物等体积
混合，使其最终浓度为30µM。
c. ⾮标记化合物浓度
各种待测样品（2×终浓度），并与60 µM放射性标记Uric acid, [8-14C]-
和60µM的Gluco D, [14C（U）]等体积混合。A1的最终浓度为1、3、10 mg/mL，B1的最终浓度为0.1、0.3、1mg/mL，C1的最终浓度为0.1、
0.3、1mg/mL，FSM1的最终浓度为0.03、0.1、0.3、1、3、10mg/mL，
FSM2的最终浓度为0.03、0.1、0.3、1、3、10mg/mL。
d. 细胞摄⼊试验
先移去培养板内培养液，将培养细胞⽤DPBS清洗两次，并在37°C
DPBS缓冲液中温浴10min，然后以500µL含放射性标记的探针底物溶
液置换DPBS开始药物的细胞内摄⼊；2min后，⽤冰浴DPBS缓冲液终
⽌反应，并清洗3次；然后各孔添加500µl 0.1mol/L NaOH裂解细胞；
提取裂解液于闪烁瓶中，添加3mL的闪烁液（Aquasol-2），并⽤Tri-Carb
2910TR液闪仪（PerkinElmer，Waltham, USA）测定样品中的放射性强
度。细胞摄⼊试验中每个浓度重复3次（n=3）。
9.4. 结果分析
9.4.1.抑制作⽤
将不含⾮放射性标记的探针底物和待测化合物物的放射性标记的探针底物的摄⼊活性定义为100%（control），以此为标准计算各种化合物存在条件下的吸收百分⽐。
9.4.2. 统计学⽅法
Mean±standard error (SD)⽤Microsoft? Excel 2010软件计算。每个数值代表⼀个实验的两个测定值的平均值。GraphPad Prism 5.0软件⽤于绘制⾮线性回归曲线图，并计算化合物对药物转运体转运活性影响的IC50。
红烧墨鱼的做法10. 结果
表1：DE降糖植物提取物A1、B1、C1对葡萄糖转运体（SGLT2）介导的14C-Gluco转运活性的影响
表2：FSM1、FSM2对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID 转运活性的影响
图1：DE降糖植物提取物A1、B1、C1对葡萄糖转运体（SGLT2）介导的14C-Gluco转运活性影响的柱形图。如图所⽰，没有添加抑制剂条件下，SGLT2对14C-Gluco的摄⼊⽐例定义为100%（control）。不同浓度A1、B1、C1的添加，使SGLT2介导的14C-Gluco摄⼊⽐例随A1、B1、C1浓度的增加明显下降，并具有显著的统计学差异。由各浓度点计算得到A1的
IC50为2.14mg/mL，B1的IC50为0.27mg/mL，C1的IC50为0.97mg/mL。
图2：FSM2对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID转运活性影响的柱形图。如图所⽰，没有添加抑制剂条件
下，hURAT1对14C-URIC ACID的摄⼊⽐例定义为100%（control）。不同浓度FSM1的添加，使hURAT1
介导的14C-URIC ACID摄⼊⽐例随浓度的增加明显下降，并具有显著的统计学差异。
图3：FSM2对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID转运活性影响的柱形图。如图所⽰，没有添加抑制剂条件
下，hURAT1对14C-URIC ACID的摄⼊⽐例定义为100%（control）。不同浓度FSM2的添加，使hURAT1介导的14C-URIC ACID摄⼊⽐例随浓度的增加⽽下降，但不具有统计学差异。
图4: FSM1号对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID转运活性影响⾮线性回归曲线。横轴为药物浓度的对数，纵轴为control摄⼊活性的百分⽐。各浓度点与曲线呈良好的相关性（R2=0.9827），由各浓度点计算得到A2对尿酸转运体（hURAT1）介导的14C-URIC ACID的抑制作⽤IC50=2.50mg/mL。
11 结论
试验结果显⽰，A1、B1、C1对SGLT2的转运活性均有抑制作⽤，其中对SGLT2的抑制作⽤活度顺序为B1(IC50=0.27mg/mL)＞C1(IC50=0.97mg/mL)＞A1(IC50=2.14mg/mL)；FSM1对hURAT1的转运活性有抑制作⽤，IC50为2.50mg/mL，FSM2对hURAT1的转运活性基本没有抑制作⽤，IC50﹥10mg/mL。
12. 参考⽂献
1) Enomoto, A. et al.: Molecular identification of a renal urate-anion exchanger that
regulates blood urate level. Nature. 2002 May 23;417 (6887):447-52.
