中国预防兽医学报
Chine Journal of Preventive Veterinary Medicine
第43卷第1期2021年1月
V ol.43No.1Jan.2021
doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202006019
铜绿假单胞菌oprL 和oprF 基因二价组合DNA
疫苗初免-灭活疫苗加强免疫效果的研究
宫
强*，翟文汉，郭利娜，杜珍奇
（河南科技大学河南省食品微生物工程技术研究中心，河南
洛阳
471023）
摘要：为探索铜绿假单胞菌oprL 和oprF 基因的二价组合DNA 疫苗pOPRL+pOPRF 初免-灭活疫苗加强免疫
的效果，本实验以铜绿假单胞菌二价组合DNA 疫苗pOPRL+pOPRF 免疫BALB/c 小鼠后再以灭活疫苗加强免疫，根据两种疫苗的免疫次数分为初免-加强免疫1组和初免-加强免疫2组，同时设置二价组合DNA 疫苗单独免疫组、灭活疫苗单独免疫组以及生理盐水对照组。免疫后间接ELISA 法测定小鼠血清抗体水平、MTT 法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平，双抗体夹心ELISA 测定小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。三免两周后将铜绿假单胞菌以1.35×1010cfu/只的剂量对各组小鼠进行攻毒试验，测定攻毒后各组小鼠的保护率。结果显示DNA 疫苗初免-灭活疫苗加强免疫诱导的小鼠血清抗体水平、刺激指数（SI ）值及小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2含量显著高于DNA 疫苗单独免疫组（p <0.05）。且初免-加强免疫1组小鼠的SI 值及分泌的IFN-γ和IL-2含量显著高于灭活疫苗组（p <0.05），但各组小鼠分泌的IL-4含量无显著差异（p >0.05）。初免-加强免疫1组、初免-加强免疫2组、灭活疫苗组和DNA 疫苗单独组的保护率分别为92%、80%、84%和72%。表明二价组合DNA 疫苗初免-灭活疫苗加强免疫策略可以诱导小鼠产生较高水平的抗体和Th1型细胞免疫应答，并可为小鼠提供较好的保护率。
关键词：铜绿假单胞菌；pOPRL+pOPRF ；DNA 疫苗；灭活疫苗；初免-加强免疫中图分类号：S852.4
文献标识码：A
文章编号：1008-0589（2021）01-0077-06
Efficacy of immune primed with oprL and oprF gene divalent DNA
vaccine and boosted with inactivated vaccine against
Pudomonas aeruginosa
GONG Qiang *,ZHAI Wen-han,GUO Li-na,DU Zhen-qi
(Henan University of Science and Technology Henan Engineering Rearch Center of Food Microbiology,Luoyang 471023,China)
Abstract :To explore the immune efficacy of divalent DNA vaccine of oprL and oprF gene combined with inactivated vaccine of Pudomonas aeruginosa ,mice were vaccinated with divalent DNA vacci
ne pOPRL +pOPRF and boosted with inactivated vaccine of Pudomonas aeruginosa .According to the frequency of immunization of the two vaccines,mice were divided into prime-boost 1group and prime-boost 2group.At the same time,the bivalent DNA vaccine group,inactivated vaccine group and normal saline control group were t up.Then the levels of rum antibody,lymphocyte proliferation assays,interferon-γ(IFN-γ),interleukin-2(IL-2)and interleukin-4(IL-4)concentrations were detected by indirect ELISA,MTT and double antibody sandwich
收稿日期：2020-06-13
基金项目：河南省自然科学基金项目（162300410068）作者简介：宫强（1979-），男，山东泰安人，副教授，博士，主要从事动物病原菌分子生物学与免疫学研究.*通信作者：E-mail ：*******************
*Corresponding author
中国预防兽医学报2021年
铜绿假单胞菌是一种常见的人畜共患致病菌，广泛存在于水、空气等自然环境及多种动物的皮肤、呼吸道等部位。该菌属于条件性致病菌，其感染常发生于医院内，尤其是重症监护室中，是医院内常见
的感染性病原菌之一，可以引起肺部感染、泌尿系统感染等多种疾病[1-2]。此外，该菌还可以引起水貂、禽类等多种动物发生出血性肺炎及败血症等，给人类健康和养殖业的发展造成一定的危害[3]。目前临床上用于该菌治疗的药物包括β-内酰胺类、氨基糖甙类等多种抗生素。但近些年来，铜绿假单胞菌的耐药性问题日益严重，已对多种抗生素产生了耐药性，且耐药性呈现逐步上升的趋势，给临床治疗带来了严峻的挑战[4-5]。
机械能是什么
疫苗免疫是预防和控制感染性疾病的有效方式之一，自18世纪发明水痘疫苗以来，各类疫苗在预防病原微生物感染方面起到了重要作用，目前虽然对于铜绿假单胞菌疫苗的研究不乏报道，然而无论在医学临床还是兽医临床上至今仍无相应的商品化铜绿假单胞菌疫苗。因此，针对该病原菌疫苗的研究势在必行。本实验在前期研究的基础上，以铜绿假单胞菌oprL和oprF基因的二价组合DNA疫苗进行初免，以灭活疫苗加强免疫，对其免疫后诱导的体液、细胞免疫水平及攻毒保护效果进行了检测，为以铜绿假单胞菌制备有效疫苗的研究奠定一定的基础。
1材料与方法
1.1菌种、实验动物及主要试剂铜绿假单胞菌CAU0792株购自中国兽医药品监察所；健康6周龄~ 8周龄BALB/c小鼠购自河南科技大学医学技术与工
程学院；羊抗鼠HRP-IgG购自诺唯赞生物科技公司；限制性内切酶Eco R I和Bam H I购自赛默飞世尔
科技公司；RPMI1640液体培养基购自Sigma公司；MTT购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；小鼠IFN-γ、IL-2和IL-4ELISA检测试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2二价组合DNA疫苗及灭活疫苗的制备按照前期的方法构建DNA疫苗[6]，按如下方法：设计用于扩增oprL和oprF基因的引物，引物序列如表1所示。以上述引物进行PCR扩增，扩增产物经胶回收纯化后以限制性内切酶Eco R I/Bam H I酶切并连接pcDNA3.1（+），转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落后以碱裂解法提取质粒，并经上述两种酶酶切鉴定后获得两种重组质粒，分别命名为pOPRL和pOPRF，将两者以等浓度等比例混合后获得二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF，并以pH7.2的1×PBS调整至1μg/μL后备用。同时制备铜绿假单胞菌悬液并调整浓度为2×1010cfu/mL，经甲醛灭活后，加入总体积6%的吐温-80搅拌均匀后作为水相，将白油和司班-80按照94 6的比例混匀，向其中加总体积2%的硬脂酸铝混合后作为油相，水相和油相按照1 2的比例混合充分乳化后制备铜绿假单胞菌灭活疫苗备用。
1.3小鼠免疫健康的6周龄~8周龄BALB/c小鼠共200只，随机平均分为5组，分别为DNA疫苗组、灭活疫苗组，初免-加强免疫1组、初免-加强免
ELISA,respectively.Two weeks after the third vaccination,mice were challenged with virulent Pudomonas aeruginosa(1.35×1010 cfu/one mou),and the protective efficacy was evaluated.The
results showed that the bivalent DNA vaccine prime-inactivated vaccine boost strategy could induce significantly higher rum antibodies,stimulation index(SI)values and the concentrations of IFN-γand IL-2than tho simply vaccinated with the bivalent DNA vaccine(p<0.05).The SI value and concentrations of IFN-γand IL-2in the prime-boost1group were significantly higher than tho in the inactivated vaccine group(p<0.05).However,no significant differences in the concentrations of IL-4among all the vaccine groups were obrved(p>0.05).The protective efficacy rate of prime-boost1group,prime-boost2group,inactivated vaccine group and bivalent DNA vaccine were92%,80%,84%and 72%,respectively.The results indicated that the divalent DNA vaccine prime-inactivated vaccine boost strategy could induce high level of antibody respon and Th1type immune respon,and provide a good protection for mice.
Key words:Pudomonas aeruginosa;pOPRL+pOPRF;DNA vaccine;inactivated vaccine;prime-boost
表1oprL和oprF基因引物序列
Table1Primers quences of oprL and oprF gene
基因Gene
oprL forward oprL rever oprF forward oprF rever
引物序列
Primer quences
5'-ATCGGGATCCATGGAAATGCTGAAATTC-3' 5'-CAGAATTCTTACTTCTTCAGCTCGACGCGAC-3' 5'-GTGGATCCATGAAACTGAAGAACACC-3'
5'-ATGGAATTCTTACTTGGCTTCAGCT-3'
78
宫强，等.铜绿假单胞菌oprL和oprF基因二价组合DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫效果的研究第1期
疫2组和生理盐水对照组。各组小鼠均进行3次免疫，每次间隔2周，每次的免疫剂量均为100μL，灭活疫苗组采用背部皮下免疫，其他组均为肌肉注射免疫，具体免疫程序如表2所示。
图1免疫小鼠血清抗体水平
Fig.1Dynamic changes of rum antibody levels in
vaccinated mice
表2各组免疫程序
Table2Immunization schedules of each group
1.4血清抗体检测各组小鼠免疫后每周采血，分离血清，以2×109cfu/mL的铜绿假单胞菌菌悬液为包被抗原，以羊抗鼠HRP-IgG（1 2000）为二抗进行间接ELISA实验，测定各疫苗组小鼠的血清抗体水平，从初免后第1周开始检测，共检测6周[7]。
1.5小鼠脾淋巴细胞增殖试验和细胞因子分泌水平的测定各组小鼠每次免疫后2周时，各取5只小鼠，MTT法测定小鼠脾淋巴细胞增殖水平。无菌采集脾脏制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为1×107个/mL。96孔细胞培养板每孔加入50μL脾细胞悬液，同时设阴性对照，每组设3个重复。试验孔每孔加入50μL 20μg/mL的（OMP），阴性对照孔每孔加入50μL RPIM 1640培养液，于37℃5%CO2培养72h后，每孔加入5mg/mL的MTT10μL，继续培养3h。然后每孔加100μL SDS-HCl，继续作用2h终止反应，测定OD570nm吸光值，计算刺激值（SI）=OD（试验孔）/OD （阴性对照孔）。同时以小鼠IFN-γ、IL-2和IL-4 ELISA检测试剂盒对各组免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的这3种细胞因子浓度进行测定[8]。
1.6攻毒试验3免2周后，以1.35×1010cfu/只的剂量对各组剩余小鼠经腹腔注射铜绿假单胞菌CAU0792株菌液，攻毒后继续饲养15d，观察记录各组小鼠的存活情况，计算各组的保护率。
1.7统计学分析采用SAS9.4统计学软件进行数据分析，采用单因素方差分析各疫苗组间差异，以p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。
2结果
2.1血清抗体测定结果初次免疫后每周采血，间接ELISA测定各疫苗组小鼠的血清特异性抗体水平。结果显示，随着免疫次数的增加，各疫苗组小鼠的血清抗体水平均呈现上升趋势，而生理盐水对照组的小鼠抗体则始终保持在较低水平。初免和二免
后各疫苗组小鼠血清抗体水平无明显差异（p>0.05）。
第3次免疫后即初免后第5周和第6周时灭活疫苗
组、初免-加强免疫1组和初免-加强免疫2组的抗体
水平显著高于DNA疫苗组（p<0.05），但前三者之间则
无显著差异（p>0.05）（图1）。表明两种初免-加强免疫
后均可在一定程度上提高二价组合DNA疫苗pOPRL+ pOPRF诱导的小鼠体液免疫应答水平。
2.2小鼠脾淋巴细胞增殖的检测分析结果每次免疫后2周时，制备免疫小鼠脾淋巴细胞悬液，MTT
法测定各组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平，结果显示初
次免疫后各疫苗组小鼠的SI值无明显差异（p>0.05）。
二免后虽然灭活疫苗组的SI值略高于其他3组，但4
组之间仍无显著差异（p>0.05）。三免后初免-加强免
疫1组的SI值极显著高于DNA疫苗组（p<0.01）及其
他两组（p<0.05），此时初免-加强免疫1组、初免-
加强免疫2组、DNA疫苗组和灭活疫苗组SI值的中
位数分别为1.91、1.71、1.61和1.79。灭活疫苗组的SI值的中位数虽稍高于初免-加强免疫2组，但两者之间差异并不显著（p>0.05），并且两组小鼠的SI值
均显著高于DNA疫苗组（p<0.05）（图2）。表明以二
组别
Groups DNA vaccine group Inactivated vaccine group Prime-boost1group Prime-boost2group Normal saline group
一免
First vaccination
pOPRL+pOPRF
Inactivated vaccine
pOPRL+pOPRF
pOPRL+pOPRF
Normal saline
二免
Second vaccination
pOPRL+pOPRF
Inactivated vaccine
pOPRL+pOPRF
Inactivated vaccine
Normal saline
三免
Third vaccination
pOPRL+pOPRF
Inactivated vaccine
Inactivated vaccine
Inactivated vaccine
Normal saline
Weeks(post first vaccination)
2.5
2
1.5
1
0.5
O
D
4
9
2
n
m
v
a
l
u
e
DNA vaccine group
123456
◇
○
Prime-boost1group
Normal saline group
Inactivated vaccine group
Prime-boost2group
◎
◎
○
◇
□△
□
△
○
○
○
○
○
赵师秀约客◎□
□
□
梅州美食□
□
◇
◇
△
△
△
△
◇
◇
◇
◎
◎
◎
◎
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中国预防兽医学报2021年
DNA vaccine group
vaccine group 2.52
1.510.50S I v a l u e
价组合DNA 疫苗初免后再以灭活疫苗加强免疫后可较好的诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖。
2.3小鼠细胞因子测定结果每次免疫2周后测定
美文美段摘抄
各疫苗组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-2和IL-4的浓度，结果显示，第1次免疫后，各疫苗组小鼠脾
淋巴细胞分泌的3种细胞因子的浓度均无显著差异（p >0.05）。二免后灭活疫苗组和初免-加强免疫2组小鼠分泌的3种细胞因子的浓度虽较DNA 疫苗组和初免-加强免疫1组略高，但4组之间仍无显著差异（p >0.05）。三免后IFN-γ和IL-2的检测结果与脾淋巴细胞增殖试验结果类似，初免-加强免疫1组的IFN-γ和IL-2的浓度极显著高于DNA 疫苗组（p <0.01）及其他2组（p <0.05），且灭活疫苗组和初免-加强免疫2组高于DNA 疫苗组（p <0.05）（图3A 、3B ），此时初免-加强免疫1组、初免-加强免疫2组、DNA 疫苗组和灭活疫苗组IFN-γ浓度的中位数分别为725.7pg/mL 、641.4pg/mL 、581.8pg/mL 和655.1pg/mL ；IL-2浓度的中位数分别为562.6pg/mL 、502.8pg/mL 、463.5pg/mL 和514.9pg/mL 。然而，第3次免疫后各疫苗组小鼠脾淋巴细胞分泌的IL-4的浓度仍无明显差异（p >0.05），虽然初免-加强免疫1组的IL-4浓度稍高于其他3组（图3C ）。表明两种
初免-加强免疫策略均可诱导免疫小鼠脾淋巴细胞分泌较高水平的Th 1型细胞因子IFN-γ和IL-2，但对Th 2型细胞因子的分泌水平无明显影响。2.4
攻毒试验结果
三免后对每组剩余的25只小
遇到挫折怎么办鼠以铜绿假单胞菌进行攻毒，继续饲养15d ，观察小鼠的存活情况。结果显示生理盐水对照组的小鼠在攻毒当天即出现死亡，至攻毒后第6d 时已全部死亡。DNA 疫苗组，灭活疫苗组，初免-加强免疫1
组和初免-加强免疫2组的小鼠在攻毒后第2d 或第
3d 逐渐出现死亡，且分别至攻毒后第6d 、第5d 、第4d 和第6d 时小鼠的存活率不再出现变化（图4）。上述各组的保护率分别为72%、84%、92%和80%。表明两种初免-加强免疫策略均可为免疫小鼠提供优于二价组合DNA 疫苗pOPRL+pOPRF 单独免疫时的保护效果。
*:p <0.05;**:p <0.01;The same as below
图2
免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平
Fig.2
Splenic lymphocytes proliferation in vaccinated mice
图4攻毒后各组小鼠存活情况
Fig.4Survival curve of vaccinated mice after challenge
800
7006005004003002001000
C o n c e n t r a t i o n s o f I F N -γ(p g /m L )DNA vaccine group Prime-boost 1group Normal saline group
Inactivated vaccine group Prime-boost 2group
6005004003002001000
C o n c e n t r a t i o n s o f I L -2(p g /m L )
500
450400350300250200150100500
C o n c e n t r a t i o n s o f I L -4(p g /m L )
图3免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ（A ）、IL-2（B ）和
IL-4（C ）水平测定结果
Fig.3Concentrations of IFN-γ(A),IL-2(B)and IL-4(C)from
spleen lymphocytes of vaccinated mice
120100806040200
S r v i v a l r a t e (%)
DNA vaccine group
Prime-boost 1group Inactivated vaccine group Prime-boost 2group
◎○
◇□
△
Normal saline group
12345
6789101112131415◇
○
△
□
◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎
○
○
○
○
○
◇◇◇
◇
◇
△
△
△
△
△
△
△◇
◇
◇
◇◇
◇
◇
◇◇□
□
□
□
□
□
□
□
□
△
△
△△△△△□□□□
□Days post challenge
C
B
A
80
宫强，等.铜绿假单胞菌oprL和oprF基因二价组合DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫效果的研究第1期
3讨论
铜绿假单胞菌作为一种常见的人畜共患病原
菌，其耐药性的日益严重给临床治疗带来了一定的
困难，而且临床上无相关商品化疫苗可用，因此研
制有效的疫苗迫在眉睫。本实验室前期以铜绿假单
胞菌的oprL和oprF基因构建了单价、二价融合和二丑八怪歌词
克烈出装价组合DNA疫苗，研究了其在鸡和小鼠体内的免疫
效果，结果均显示二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF
具有一定的应用前景，但其免疫效果仍不及灭活疫
苗[6,9-10]。为进一步提高该组合DNA疫苗的免疫效
果，本实验以组合DNA疫苗初免，以灭活疫苗加强
免疫研究了初免-加强免疫策略在小鼠体内的免疫
疝气带效果。
初免-加强免疫一般是指以两种不同的疫苗先
后进行免疫的策略，目前已在结核分枝杆菌、流感
病毒、寨卡病毒等多种疫苗的研究中表现出了良好
的免疫效果[11-13]。将该免疫策略用于提高DNA疫苗
免疫效果的研究较为多见。如鞠斌等的研究表明以DNA疫苗初免，以重组痘苗病毒载体疫苗和蛋白疫苗加强免疫可在小鼠体内诱导广泛持久的HIV-1特
异性体液免疫和细胞免疫应答[14]。王婵等以BCG初
免，以IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加
强免疫小鼠，结果可诱导较高水平的体液和细胞疫
免疫应答水平[15]。此外，以该策略增强PRRSV、空
肠弯曲、丙型肝炎病毒等DNA疫苗免疫效果的研究
均有相关报道[16-18]。
本实验对两种不同初免-加强免疫策略进行了
研究，其一以组合DNA疫苗初免2次，以灭活疫苗
加强免疫1次，其二则以组合DNA疫苗初免1次，
以灭活疫苗加强免疫2次。DNA疫苗可诱导较好的
细胞免疫应答，而灭活疫苗诱导体液免疫应答的能
力较强。将两者通过初免-加强免疫策略进行组合
后可有望融合两者的优势，从而提高疫苗总体的免
疫效果。郭自成等研究了IBV N基因DNA疫苗初
免-灭活疫苗加强免疫的效果，其研究结果显示该
策略可诱导高于单独用DNA疫苗免疫时的抗体水
平，且可提高免疫动物外周血CD4+T和CD8+T细胞的含量，同时可为实验动物提供更高的保护率[19]。
本实验对两种初免-加强免疫策略诱导的免疫小鼠血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平及细胞因子分泌水平进行了检测，结果显示两种策略诱导的抗体水平均优于DNA疫苗单独免疫组，但并不优于灭活
疫苗单独免疫组，表明以组合DNA疫苗初免后再以
灭活疫苗加强免疫可在一定程度上增强DNA疫苗诱
导的抗体应答。经过3次免疫后，两种初免-加强免
疫策略诱导的脾淋巴细胞增殖水平及其分泌的两种Th1型细胞因子的水平均明显优于DNA疫苗组，且初免-加强免疫1组的效果更优，甚至优于灭活疫
苗，表明两种初免-加强免疫策略尤其是以组合DNA疫苗初免2次，以灭活疫苗加强免疫1次时可诱导小鼠产生较高水平的Th1型免疫应答。虽然两种策略可诱导优于DNA疫苗单独免疫时的抗体应答水平，但其免疫小鼠分泌的Th2型细胞因子IL-4的浓度并不高于DNA疫苗单独免疫组和灭活疫苗单独免疫组，表明两种初免-加强免疫策略对Th2型免疫应答的影响相对较弱。攻毒试验结果显示两种免疫策略为实验动物提供的保护效果均优于二价组合DNA疫苗单独免疫组，且第一种策略的保护效果高于灭活疫苗，显示出该免疫策略具有一定的应用前景，从而为铜绿假单胞菌有效可用疫苗的研究提供了一定的参考。
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