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基础免疫学·
ＴＮＢＳ／乙醇溃疡性结肠炎大鼠模型差异表达ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ共表达分析
钦丹萍 周毅骏 杨雪静 张春丽 李艳平 代群 孙佩娜
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４-５１０１．２０１５．１０．００５基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１２７３９０３）
作者单位：３１０００６杭州，浙江中医药大学附属第一医院消化内科（钦丹萍），中心实验室（杨雪静，李艳平，代群），病理科（张春丽）；浙江中医药大学第一临床医学院（钦丹萍，周毅骏，孙佩娜）
通信作者：钦丹萍，Ｅｍａｉｌ：ｑｉｎｄｐ１９８４１＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ，电话：０５７１-８７０６８００１
medicine可数吗【摘要】 目的 研究２，４，６-三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ）／乙醇溃疡性结肠炎（ＵＣ）大鼠中，ＵＣ相关ｍｉＲＮＡ的调控作用，即ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ互作关系。方法 用ＴＮＢＳ／乙醇灌肠，诱
导ＵＣ大鼠模型。经过造模与１４ｄ生理盐水灌胃后，解剖处死。留取正常组与模型组大鼠相应的结肠组织。通过大体及镜下观察，验证造模效果。同时对相应结肠组织进行ｍｉＲＮＡ芯片检测，根据芯片结果及相关文献报道，筛选出与ＵＣ发病密切相关的ｍｉＲＮＡ并对其进行ＲＴ-ＰＣＲ验证。另外，利用ｍｉＲＷａｌｋ数据库对差异ｍｉＲＮＡ的靶基因进行预测。为了验证预测结果与实际情况的相符度，又同步进行了ｍＲＮＡ水平的表达谱芯片实验，筛选出与差异ｍｉＲＮＡ确有互作作用的ｍＲＮＡ。为了更好地说明ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ的互作关系，又利用Ｄａｖｉｄ数据库对靶基因进行注释，最终形成ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ共表达网络。结果模型组大鼠结肠大体及镜下表现均符合ＵＣ的发病特征。通过ｍｉＲＮＡ芯片筛选出了６８个差异ｍｉＲＮＡ［倍数变化（ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ）＞２，P ＜０．０５，表达值（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅａｎ）＞７］，结合相关文献报道，筛选出６个与ＵＣ发病密切相关的ｍｉＲＮＡ。同时对这６个ｍｉＲＮＡ进行了ＲＴ-ＰＣＲ实验，结果提示，与正常组相比，４个差异ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐ、ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-１２６ａ-３ｐ和ｍｉＲ-２１-５ｐ）表达明显上调（P ＜０．０１，P ＜０．０５），２个差异ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ-２００ｂ-３ｐ、ｍｉＲ-１４５-５ｐ）表达明显下调（P ＜０．０１）。结合ｍｉＲＷａｌｋ数据库对这６个差异ｍｉＲＮＡ的靶基因预测结果和表达谱芯片结果，本研究发现ＩＬ-６、Ｃｃｌ５、Ｍａｐｋ３、Ｓｍａｄ７这４个ｍＲＮＡ与上述６个ｍｉＲＮＡ有互作关系。最终通过Ｄａｖｉｄ数据库对这种互作关系进行注释，以阐明其在ＵＣ发病中的重要作用。结论 一个ｍｉＲＮＡ可以调控多条信号通路，而一条信号通路又受到多个ｍｉＲＮＡ的调控。如果仅仅单纯抑
制某条信号通路，可能并不能从根本上抑制炎症的发生。而从其上游出发，研究ｍｉＲＮＡ作用，阐明相互关系，并调控ｍＲＮＡ的作用，可能可以从根本上逆转疾病的进程。
【关键词】 ｍｉＲＮＡ；ＴＮＢＳ／乙醇溃疡性结肠炎（ＵＣ）大鼠模型；表达谱；共表达分析
Analysis of the co -expression of miRNA and mRNA in rats with TNBS ／ethanol induced ulcerative
colitis Qin Danping *
，Zhou Yijun ，Yang Xuejing ，Zhang Chunli ，Li Yanping ，Dai Qun ，Sun Peina ．*
Department of Gastroenterology ，the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chine Medical University ，Zhe -jiang 310006，China
Corresponding author ：Qin Danping ，Email ：qindp19841＠sina ．com
【Abstract 】 Objective ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲＮＡａｎｄｍＲＮＡ（ｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｉＲＮＡ）ｉｎａｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｔｒｉｎｉｔｒｏ-ｂｅｎｚｅｎｅ-ｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＴＮＢＳ）／ｅｔｈａｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄｕｌｃｅｒａｔｉｖｅｃｏｌｉｔｉｓ
（ＵＣ）．Methods ＴＮＢＳａｎｄｅｔｈａｎｏｌｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｎｄｕｃｅｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＵＣｉｎｒａｔｓ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｍｏｄｅｌｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅａｎｄｏｒａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ（ＮＳ）ｆｏｒ１４ｄａｙｓ，ｒａｔｓｆｒｏｍｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｄｉｓｓｅｃｔｅｄｔｏｃｏｌｌｅｃｔｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｏｆｃｏｌｏｎｉｃｍｕｃｏｓａ．ＧｅｎｅｒａｌａｎｄｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｖａｌｉｄａｔｅｔｈｅｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆＵＣ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲＮＡｗａｓｐｒｏｆｉｌｅｄｕｓｉｎｇｍｉＲＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ＴｈｅｔａｒｇｅｔｍｉＲＮＡｓｔｈａｔｗｅｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＵＣｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｏｕｔａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｉ-ｃｒｏａｒｒａｙａｎｄｒｅｌａｔｅｄｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｓ．ＲＴ-ＰＣＲｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡｓ．Ｔｈｅ
ｍｉｒＷａｌｋｄａｔａｂａｓｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｏｆｍｉＲＮＡｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｖｅｒｉｆｙｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｉｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅａｃｔｕａｌｒｅｓｕｌｔｓ，
ｔｈｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．ＴｈｅｇｅｎｅｓｔｈａｔｓｈｏｗｅｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｔｈｏｓｅｍｉＲＮＡｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔ．ＴｈｅＤａｖｉｄｄａｔａｂａｓｅｗａｓ
ｕｓｅｄｆｏｒｇｅｎｅａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ＡｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｎｅｔｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲＮＡａｎｄｍＲＮＡｗａｓｆｏｒｍｅｄ．ResultsＧｅｎｅｒａｌａｎｄｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｏｆｃｏｌｏｎｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｆｅａｔｕｒｅｓｏｆＵＣ．Ｓｉｘｔｙ-ｅｉｇｈｔｍｉＲＮＡｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｂｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｒａｔｓｆｒｏｍｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ＞２，P＜０．０５，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅａｎ＞７）．ＳｉｘｃａｎｄｉｄａｔｅｍｉＲＮＡｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｈａｖ-ｉｎｇｃｌｏｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｔｏｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＵＣｒｅｆｅｒｒｉｎｇｔｏｒｅｐｏｒｔｅｄｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｗｈｉｃｈｗａｓｃｈｅｃｋｅｄａｎｄｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｒｅａｌ-ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，４
ｍｉＲＮＡｓ（ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐ，ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐ，ｍｉＲ-１２６ａ-３ｐａｎｄｍｉＲ-２１-５ｐ）ｗｅｒｅｕｐ-ｒｅｇｕｌａｔｅｄ（P＜０．０１，P＜０．０５）ａｎｄ２ｍｉＲＮＡｓ（ｍｉＲ-２００ｂ-３ｐａｎｄｍｉＲ-１４５-５ｐ）ｗｅｒｅｄｏｗｎ-ｒｅｇｕｌａｔｅｄ（P＜０．０１）ｉｎｒａｔｓｗｉｔｈＴＮＢＳ／ｅｔｈａｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄＵＣ．ＦｏｕｒｍＲＮＡｓ（ＩＬ-６，Ｃｃｌ５，Ｍａｐｋ３ａｎｄＳｍａｄ７）ｔｈａｔｉｎｔｅｒａｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅ６ｍｉＲＮＡｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｂｏｖｅ６ｍｉＲＮＡｓａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏ-ｆｉｌｉｎｇ．ＴｈｅＤａｖｉｄｄａｔａｂａｓｅｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎｎｏｔａｔｅｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｆｏｒｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇｔｈｅｉｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｔｈｅｐａｔｈ-ｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＵＣ．ConclusionＡｍｉＲＮＡｃａｎｒｅｇｕｌａｔｅｍａｎｙｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓａｎｄａｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｃａｎａｌｓｏｂｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｍａｎｙｍｉＲＮＡｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｓｉｍｐｌｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｃｅｒｔａｉｎｐａｔｈｗａｙｓｍａｙｎｏｔｒａｄｉｃａｌｌｙｓｔｏｐｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．ＳｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｍｉＲＮＡｓａｎｄｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲＮＡａｎｄｍＲＮＡｍｉｇｈｔｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＵＣ．
【Key words】 ｍｉＲＮＡ；ＡｒａｔｍｏｄｅｌｏｆＴＮＢＳ／ｅｔｈａｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄＵＣ；Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ；Ｃｏ-ｅｘ-ｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ
溃疡性结肠炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）是炎症性肠病（ＩＢＤ）的一种，它是一种结肠黏膜的特发性、慢性、炎症性疾病，病变常连续，可受累直肠、乙状结肠、左半结肠甚至全结肠。目前认为环境、遗传和宿主免疫三者高度互动的关系对维持肠道稳态有重要意义。三者关系一旦失衡，就会导致共生细菌之间的稳态失衡和肠黏膜系统免疫力异常，引起ＵＣ。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是一种由１９～２２个核苷酸组成的非编码微小内源性ＲＮＡ，它可以调控基因表达。ｍｉＲＮＡ由真核生物细胞核内的ＤＮＡ编码，作用于３′非编码区（３′ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ，３′ＵＴＲ），最终通过抑制ｍＲＮＡ转录或目标ｍＲＮＡ降解的方式，使得靶基因表达下调；或者开放某些ｍＲＮＡ的转录，使得靶基因表达上调［１］。到目前为止，人类基因组中近一半的基因受到将近２５５８个成熟ｍｉＲＮＡ的调控［２］。
最近有研究证实，因ｍｉＲＮＡ绑定方式的多样性，ｍｉＲＮＡ在ＵＣ的发病过程中扮演重要角色［３］。但是，至今为止，ｍｉＲＮＡ对ＵＣ发病机制的调控尚未完全阐明。因此，筛选出差异表达的ｍｉＲＮＡ，并且找出其作用的靶基因，可以为进一步揭示ＵＣ的病理生理学过程提供实验资料。
２，４，６-三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ）／乙醇大鼠模型为研究ＵＣ的极佳对象，因抗原接种可引起大鼠免疫系统致敏［４］。乙醇可以破坏肠黏膜屏障，而ＴＮＢＳ作为一种半抗原物质，可以导致肠道对自体或异体蛋白致敏，对宿主免疫系统产生攻击。ＴＮＢＳ引起的结肠黏膜水肿可导致肠道急性炎症反应，引起Ｔｈ１细胞因子（ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１２）和Ｔｈ２细胞因子（ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-１３）的失衡［５］。一旦ＴＮＢＳ／乙醇被灌注后，可引起炎症细胞浸润及溃疡。与此同时，大鼠结肠在形态学上与人体的结肠相似，引起的炎症反应与ＵＣ患者体内的疾病进程也相似，为研究ＵＣ的极佳模型。
尽管目前针对ＩＢＤ患者差异表达的ｍｉＲＮＡ研究很多［６］，但对差异表达ｍｉＲＮＡ的靶基因研究也仅仅停留在预测阶段，而针对ＴＮＢＳ／乙醇ＵＣ大鼠模型中ｍｉＲＮＡ差异表达的研究迄今仍尚未涉及，对差异表达ｍｉＲＮＡ的靶基因的认识也尚未完善。因此本文尝试通过ｍｉＲＮＡ及表达谱芯片的研究手段，探讨ＴＮＢＳ／乙醇ＵＣ大鼠模型中ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ的共表达互作网络，为深入研究ＵＣ发病机制提供资料。
材料和方法
动物：ＳＰＦ级雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠３０只，体重（２００±２０）ｇ，由浙江中医药大学动物中心提供，常规饲养。
试剂与仪器：５％ＴＮＢＳ（Ｓｉｇｍａ公司，生产批号：ＳＬＢＧ２５６６Ｖ）；１０％水合氯醛（浙江中医药大学附属第一医院，生产批号：２０１３１２０５）；无水乙醇（杭州龙山精细化工有限公司，生产批号：２０１３１２０６）；中心静脉导管（上海景年医疗器械有限公司，标准编号：ＹＺＢ／ＵＳＡ３９６６-２０１１）。
利莫那班模型建立：大鼠适应性喂养１周左右，使体重到（２００±２０）ｇ，禁食２４ｈ。１０％水合氯醛３ｍｌ／ｋｇ腹腔麻醉后，将石蜡油润滑过的深静脉置管由肛门缓慢插入肛门８ｃｍ处，模型组按每只大鼠０．２ｍｌ／１００ｇ５％ＴＮＢＳ＋０．２５ｍｌ５０％乙醇进行灌肠，正常组按０．２ｍｌ／１００ｇ生理盐水＋０．２５ｍｌ生理盐水进行灌肠，灌肠结束加推０．３ｍｌ空气，用棉签堵住大鼠肛门，轻柔大鼠腹部１ｍｉｎ并倒置５ｍｉｎ，造模结束
后将大鼠平放，自然清醒后常规饮食。
动物分组及给药：将３０只健康Ｗｉｓｔａｒ大鼠分为２组，分别为正常组、模型组，每组１５只。造模成功后第４天，按１０ｍｌ／ｋｇ分别给予相应剂量的生理盐水。每天１次，连续１４ｄ。
标本采集：末次给药２４ｈ后，处死大鼠，留取距离肛门８ｃｍ处病变最明显的组织（模型组）和相应的正常组织（正常组），进行相关检测。
结肠大体及病理学检测：结肠炎严重度评价由两位病理学专家双盲法完成读片。通过大体观察及拍照，判定造模情况。留取溃疡组织（模型组）与相应的正常组织（正常组），将其固定于４％福尔马林溶液中。固定后的组织用石蜡包埋并切片。经过
ＨＥ染色后进行镜下观察。
miRNA芯片实验流程：利用ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｃａｔ＃ＡＭ１５６０，Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳ）抽提总ＲＮＡ。用ＡｇｉｌｅｎｔＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ２１００（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ）对抽提的ＲＮＡ进行质检。而后进行ｍｉＲＮＡ芯片实验。一张ｍｉＲＮＡ芯片包含ｍｉＲＢａｓｅ数据库１９．０版本的７１９个大鼠ｍｉＲＮＡ。利用ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ（Ｃａｔ＃５１９０-０４５６，Ａｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌ-ｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳ）标记样本。在４２℃环境下杂交１６ｈ，然后进行洗片，最后用信号方法器放大。利用ＧｅｎｉｏｍＷｉｚａｒｄＳｏｆｔｗａｒｅ（ＦｅｂｉｔＧｍｂＨ）来分析芯片。
表达谱芯片实验流程：按前述方法抽提总ＲＮＡ。采用Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ表达谱芯片配套试剂盒Ｇｅ-ｎｅＣｈｉｐ３′ＩＶＴＰＬＵＳＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ（Ｃａｔ＃９０２４１６，Ａｆｆｙ-ｍ
ｅｔｒｉｘ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳ）对样品总ＲＮＡ中的ｍＲＮＡ进行放大、标记和纯化，获得带有生物素（ｂｉ-ｏｔｉｎ）标记的ｃＲＮＡ。按照Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒完成杂交洗涤工作。芯片结果采用ＧｅｎｅＣｈｉｐ®Ｓｃａｎｎｅｒ３０００（Ｃａｔ＃００-００２１２，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳ）进行扫描，用ＣｏｍｍａｎｄＣｏｎｓｏｌｅＳｏｆｔｗａｒｅ４．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳ）读取原始数据，质控合格的数据采用ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＳｏｆｔｗａｒｅ１１．０（Ａｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏ-ｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳ）进行归一化处理，所用的算法为ＭＡＳ５．０。
RT-PCR实验流程：按ＲＮＡ抽提试剂盒说明书提取总ＲＮＡ，紫外分光光度计测定总ＲＮＡ浓度，重复测定３次，取５００ｎｇＲＮＡ按逆转录试剂盒说明书（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）进行逆转录反应合成ｃＤＮＡ，用ＡＢＩ７５００ＰＣＲ仪（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）按ＲＴ-ＰＣＲ说明书将ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，以Ｕ６为内参。ｍｉＲＮＡ的相对表达量以２-ΔΔＣｔ的形式表达。
统计学方法：采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件处理数据。数据以-x±s或图表形式表示，各组数据间采用单因素方差分析检验，P＜０．０５为差异有统计学意义。
结果
1．形态学观察结果：与正常组的组织相比，模型组大体特征为：明显深凹溃疡，周边黏膜组织明显充血水肿，黏膜粗糙；模型组组织学特征为：透壁性坏死，水肿，黏膜层散在炎症细胞浸润。结肠黏膜上皮有灶性溃疡，可达黏膜肌层，伴有肠上皮细胞缺失。具体大体及镜下照片见图１。
2．TNBS／乙醇UC大鼠模型中miRNA差异表达情况：为了研究模型组与正常组ｍｉＲＮＡ表达的差异情况，各组选取了３个样本进行ｍｉＲＮＡ芯片实验，６张芯片的检出率为９．４６％，共有６８个ｍｉＲＮＡ被筛选出具有显著差异（筛选标准为：倍数变化＞２，P＜０．０５，表达值＞３），具体的芯片热图结果见图２。结合相关文献报道，我们选出６个与ＩＢＤ发病密切相关的ｍｉＲＮＡ，其中４个表达上调（ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐ、ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-１２６ａ-３ｐ和ｍｉＲ-２１-５ｐ），２个表达下调（ｍｉＲ-２００ｂ-３ｐ和ｍｉＲ-１４５-５ｐ），同时对这６个ｍｉＲＮＡ进行了ＲＴ-ＰＣＲ验证，将正常组的各差异表达的ｍｉＲＮＡ相对表达量设为１，通过管家基因Ｕ６，校正得出模型组各差异ｍｉＲＮＡ的相对表达量。ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐ、ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-１２６ａ-３ｐ、ｍｉＲ-２１-５ｐ、ｍｉＲ-２００ｂ-３ｐ及ｍｉＲ-１４５-５ｐ在模型组中的相对表达量分别为３．０８±０．３２、８．７５±０．１４、２．０５±０．２２、２．１３±０．０９、０．０１±０．３９和０．４３±０．５１。具体结果见图３。
3．TNBS／乙醇UC大鼠模型中mRNA差异表达情况：与此同时，为了研究ｍｉＲＮＡ对ｍＲＮＡ的作用，采用上述做ｍｉＲＮＡ芯片的样本同步做了表达谱芯片实验。两组中共有４１８０个差异ｍＲ深化文化体制改革
ＮＡ被筛选出（筛选标准：变化倍数＞２，P＜０．０５，表达值＞７），具体的芯片热图结果见图４。我们将ｍｉＲＷａｌｋ数据库对ｍｉＲＮＡ芯片筛选出的６个ｍｉＲＮＡ的靶基因ｍＲＮＡ预测的结果和实际的表达谱芯片结果进行比对，筛选出了４个与ＩＢＤ发病密切相关的靶基因ｍＲＮＡ（ＩＬ-６、Ｍａｐｋ３、Ｓｍａｄ７、Ｃｃｌ５），具体的芯片信号
注：Ａ：正常组结肠组织显示了正常结肠黏膜的形态：没有坏死及溃疡；Ｂ：模型组结肠组织出现一个１．３ｃｍ线性溃疡（黑色箭头）及一处小的点状溃疡；Ｃ：正常组结肠组织显示了正常结肠组织镜下形态：完整清晰的肠上皮细胞，完整的腺体结构（×１００）；Ｄ：模型组结肠组织可见炎症侵及黏膜层、黏膜下层及黏膜肌层，杯状细胞在上皮细胞表面完全缺失（×１００）。１：黏膜层；２：黏膜下层；３肌层；４：浆膜层
图1 各组大鼠结肠组织大体及镜下形态学表现
Fig 1
．Ｇｅｎｅｒａｌａｎｄｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓｏｆｒａｔｃｏｌｏｎｔｉｓｓｕｅｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓ
图2 ｍｉＲＮＡ芯片筛选出的６８个显著差异表达的ｍｉＲＮＡ热图Fig 2．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｆ６８ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡｓ
注：与正常组比较，ａP ＜０．０１，ｂP ＜０．０５。１：ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐ；２：ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐ；３：ｒｎｏ-ｍｉＲ-１２６ａ-３ｐ；４：ｒｎｏ-ｍｉＲ-２１-５ｐ；５：
ｒｎｏ-ｍｉＲ-２００ｂ-３ｐ；６：ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４５-５ｐ
图3 ６个差异表达的ｍｉＲＮＡＲＴ-ＰＣＲ结果
Fig 3．ＲＴ-ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆ６ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡｓ
值及变化倍数值见表１。
4．miRNA 及mRNA 共表达分析：根据ｍｉＲＮＡ芯片与ｍＲＮＡ水平的表达谱芯片结果，我们尝试建立ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ的互作关系网络；同时为了研究这些靶基因ｍＲＮＡ在ＵＣ发病中的分子机制，我
们又借助Ｄａｖｉｄ数据库对其进行了注释，即ｐａｔｈｗａｙ分析，具体分析结果见表２。ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ及信号通路之间的互作网络关系图，详见图５。
图4表达谱芯片筛选出的４１８０个显著差异表达的ｍＲＮＡ热图
Fig4．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｆ４１８０ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘ-ｐｒｅｓｓｅｄｍＲＮＡｓ
透明图片格式表1靶基因信号值和变化倍数值
Table1．Ｓｉｇｎａｌａｎｄｆｏｌｄｃｈａｎｇｅｖａｌｕｅｓｆｏｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓ
项目变化倍数模型组（信号值）正常组（信号值）
ＩＬ-６３５．１４１０．０６±０．２２ａ４．５８±１．３９我们来找茬
Ｃｃｌ５４．４３１１．８４±０．３４ａ９．６６±０．４８
Ｍａｐｋ３０．３９１０．１１±０．３７ｂ１１．５０±０．２３
Ｓｍａｄ７０．４９９．１１±０．３１ｂ１０．１４±０．２２
注：与正常组比较，ａ表示表达明显升高，P＜０．０５，ｂ表示表达明显降低，P＜０．０５
讨论
炎症性肠病（ＩＢＤ）的发病机制尚未阐明，主流观点认为，ＩＢＤ的发病是环境、遗传和宿主免疫三者互动关系失衡所致。最新研究发现，ｍｉＲＮＡ在ＩＢＤ的发病中发挥重要作用，其可通过绑定ｍＲＮＡ３′ＵＴＲ端，抑制ＩＢＤ相关基因的表达［３］。同时，肠道相关ｍｉＲＮＡ表达的缺失已
被证实可以破坏肠上皮细胞及上皮屏障功能，最终导致急性炎症［１４］。
正是基于上述理论基础，我们首先建立了ＴＮＢＳ／乙醇ＵＣ大鼠模型，模型组在造模后，出现了精神萎靡、饮食减少、毛发稀疏、大便次数增多，伴有黏液脓血便等ＵＣ相关症状。实验结束后解剖大鼠，病变结肠与周围组织黏连，出现较大的溃疡病
使用用英语怎么说表2差异ｍｉＲＮＡ信号通路分析结果一览
Table2．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡｓ
信号通路ｍｉＲＮＡｓ目的基因
Ｊａｋ-ＳＴＡＴｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐＩＬ-６↑［７］
ＭＡＰＫｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐＭａｐｋ３↓［８］
ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐＭａｐｋ３↓［８］
ｒｎｏ-ｍｉＲ-２１-５ｐＭａｐｋ３↓［９］
ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４５-５ｐＭａｐｋ３↓［１０］
ＮＯＤ-类受体ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐＩＬ-６↑，Ｃｃｌ５↑［１１］，Ｍａｐｋ３↓
ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐＭａｐｋ３↓，Ｃｃｌ５↑［１１］
ｒｎｏ-ｍｉＲ-２１-５ｐＭａｐｋ３↓
ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４５-５ｐＭａｐｋ３↓
ＴＧＦ-βｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐＳｍａｄ７↓［１２］，Ｍａｐｋ３↓
ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐＳｍａｄ７↓［１２］，Ｍａｐｋ３↓
ｒｎｏ-ｍｉＲ-２１-５ｐＳｍａｄ７↓［１３］，Ｍａｐｋ３↓
专业技术报告ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４５-５ｐＳｍａｄ７↓［１２］，Ｍａｐｋ３↓
Ｔｏｌｌ样受体ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ａ-５ｐＩＬ-６↑，Ｃｃｌ５↑，Ｍａｐｋ３↓
ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４６ｂ-５ｐＣｃｌ５↑，Ｍａｐｋ３↓
小水电站
ｒｎｏ-ｍｉＲ-２１-５ｐＭａｐｋ３↓
ｒｎｏ-ｍｉＲ-１４５-５ｐＭａｐｋ３↓
注：在ＴＮＢＳ／乙醇ＵＣ大鼠模型中，相关ｍｉＲＮＡ的改变，引起相应靶基因的改变，↑表示表达明显上调
，↓表示表达明显下调
图5ＴＮＢＳ／乙醇ＵＣ大鼠模型中ＩＢＤ相关ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ互作网络关系图
Fig5．Ｃｏ-ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉＲＮＡａｎｄｍＲＮＡｉｎｒａｔｓｗｉｔｈＴＮＢＳ／ｅｔｈａｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄＵＣ
灶，周围组织充血水肿，高倍镜下可见结肠黏膜水肿，浆膜层及浆肌层可见大量炎症细胞浸润，溃疡形成，表面可见坏死层，伴肉芽组织增生。大鼠一般情况，大体及镜下表现均证实造模成功。接着，为了研究ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ的互作关系，我们首先进行了ｍｉＲＮＡ芯片实验，根据芯片数据及相关文献报道，筛选出了６个与ＵＣ发病密切相关的ｍｉＲＮＡ。同时利用ＲＴ-ＰＣＲ的方法对差异表达的ｍｉＲＮＡ进行了验证。另外，我们还利用ｍｉＲＷａｌｋ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａ．ｕｎｉｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ａｐｐｓ／ｚｍｆ／ｍｉｒｗａｌｋ／）对差异ｍｉＲＮＡ的靶基因进行预测。为了验证预测结果与实际情况的相符度，同步进行了ｍＲＮＡ水平的表达谱芯片实验，筛选出与差异ｍｉＲＮＡ确有互作作用的ｍＲＮＡ。为了更好地说明ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ的互作关系，利用Ｄａｖｉｄ数据库［１５］对靶基因进行注释，最终形成ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ共表达网络。
