基础医学与临床Basic&Clinical Medicine退学生会申请书
June2021 Vol.41No.6
2021年6月
第41卷第6期
文章编号：1001-6325(2021)06-0779-07研究论文精神分裂症“二次打击”小鼠模型的建立与评价
尤鹏升，韦晖，许琪
*
优的成语
(中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系
医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
摘要：目的探究精神分裂症的风险因素孕期感染和产后炎性反应对疾病表型是否具有累加效应。方法给GD
9.5孕鼠腹腔注射聚肌胞昔酸建立母体免疫激活模型，其子代于青春期或成年早期再次注射poly I:C，建立“二次
打击”小鼠模型:1)通过ELISA和RT-qPCR检测模型小鼠外周血和大脑中的炎性因子表达；2)通过前脉冲抑制和MK-801诱导的自发活动等行为学实验，检测小鼠的精神分裂症表型。结果1)MIA小鼠成年后表现出明显的行为学改变，如感觉运动门控障碍、MK-801的高敏感性等，且雌性小鼠受累程度较雄性小鼠更重；2)“二次打击”之后，MIA小鼠的感觉运动门控障碍减轻，精神分裂症相关表型部分缓解。结论青春期或成年早期的炎性反应与孕期感染间不存在协同的病理效应。
关键词：精神分裂症；母体免疫激活；二次打击;poly I:C
中图分类号:R338.2文献标志码:A
Establishment and evaluation of a two-h让model of mou schizophrenia
YOU Peng-sheng,WEI Hui,XU Qi*
(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology,Department of Molecular Biology and Biochemistry,
Institute of Basic Medical Science CAMS,School of Basic Medicine PUMC,Beijing100005,China)
Abstract:Objective Prenatal infection and postpartum inflammatory experiences have been associated with incread risk of schizophrenia・To explore whether prenatal immune activation and prepubertal inflammation have cumulative impact on vulnerability to schizophrenia.Methods Polyinosinin-polycytidylic acid was injected into pregnant mice to establish maternal immune activation models on gestation day9.5.Offspring were treated with poly I：C during puberty or adulthood as the cond h让.1)Using ELISA and quantitative real-time PCR to detect inflammatory respon after administration of poly I:C.2)The effects of single or combined exposure to prenatal immune activation and prepubertal inflammation were examined by prepul inhibition and locomotor reactions to dizocilpine (MK-801).Behavioral asssment took place when the animals reached adulthood・Results1)Offspring from poly I:C-treated mothers showed nsorimotor gating deficiency,as well as in the precipitation of behavioral hypernsitivity to the drugs dizocilpine，which were similar with schizophrenia.The phenotype of female was
收稿日期：2021-02-24修回日期：2021-04-16
基金项目：国家自然科学基金(81625008,81930104,31970952)；国家重点研发计划(2016YFC1306700,2020YFA0804502)；
北京市科技计划(Z181100001518001)；中国医学科学院创新工程项目(2016J2M亠004)；广东省重点领域研发计划(2018B030334001)
*通信作者(coiresponding author):xuqi@pumc.edu
780基础医学与临床Basic&Clinical Medicine2021.41(6) more pronounced than male.2)However,double-hit modeFs nsorimotor gating deficient level was lower than that of prenatal immune activation model,and the phenotype of schizophrenia was relieved after cond hit. Conclusions There is no synergistic pathological effect of prenatal immune activation plus pre-pubertal or adulthood inflammation.
Key words:schizophrenia;maternal immune activation;two-hit;poly I:C
精神分裂症（schizophrenia）是一种高异质性的重症精神疾病。流行病学结果显示，精神分裂症多发于青春期晚期或成年早期，人群终生患病率约为1%[1]，男女患病率基本相同，但男性患者普遍发病年龄较早，症状更加严重。
精神分裂症的神经发育假说认为，生命早期的大脑发育缺陷积累是该疾病的重要病因学基础之一⑵。流行病学研究发现，母体妊娠期间感染风疹、弓形虫、流感病毒等会增加子代精神分裂症的发病风险
⑶。在妊娠中期向母鼠注射聚肌胞昔酸（polyinosinin-polycytidylic acid,poly I: C）或脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），模拟病毒感染的炎性反应，子代成年后表现出精神分裂症样的表型⑷。青春期也是神经发育的关键节点，青春期的不良事件是精神分裂症的高危风险因素之一。基于流行病学、精神分裂症复杂的遗传学以及延迟发病的现象，有人提出精神分裂症的“二次打击”假说⑸，认为产前感染和产后应激具有累积效应，也就是说围产期感染使发育中的大脑对青春期的不良事件更为敏感，增加了大脑的脆弱性⑻，从而增加子代患精神分裂症的风险。本研究旨在探究孕期感染和产后炎性反应对精神分裂症的发生是否具有协同效应。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物：SPF级成年C57BL/6J雄鼠10只，雌 鼠20只，体质量20~25g，购买于斯贝福（北京）生 物技术有限公司（合格证号：110324200102749567、110324200102750947）在中国医学科学院动物中心饲养。饲养标准为5只/笼，温度区间为20r~ 24°C，湿度区间为50%-70%，光照时间为8:00~ 20:00，自由饮水摄食。
1.1.2主要试剂：polyinosinin-polycytidylic acid和地佐环平（Sigma-Aldrich公司）；Mou IL-6、IL-10和TNF-a试剂盒（R&D公司）；FastStart Esntial DNA Green Master（Roche公司）；Trizol（In
vitrogen公司）。
1.2方法
1.2.1“二次打击”模型的建立（图1）：9周龄雌鼠与雄鼠2：1合笼过夜，次日取出雄鼠，雌鼠记为GD 0.5o孕鼠于GD9.5⑺时随机分成两组，按照10mg/kg单次腹腔注射poly I：C或0.9%氯化钠溶液，子代小鼠分别为母体免疫激活（maternal immune activation,MIA）小鼠和对照小鼠。子代小鼠生长至3周时雌雄分笼，分别于3周（龄）、6周（龄）时第2次注射poly I：C（10mg/kg）或0.9%氯化钠溶液。小鼠正常饲养至8周行为学检测。
1.2.2ELISA检测炎性因子：小鼠注射poly I：C或0.9%氯化钠溶液，分别在注射后3、12、24h共3个时间点取血静置，离心后吸取上层无色透明血清，于-20弋保存备用。参照ELISA检测说明书进行抗体包被、标准品及样品检测，利用分光光度计在波长450nm以及540nm处记录吸光度值，制作标准浓度曲线，计算血清中IL-6、IL-10以及TNF-a的浓度。
1.2.3RNA提取与基因表达量的检测：取新鲜海马和皮层组织，利用Trizol匀浆和氯仿分层法分离RNA。用cDNA反转录试剂盒将600ng RNA反转录成cDNA进行RT-qPCR检测。
1.2.4行为学检测：前脉冲抑制（prepul inhibition,PPI）和MK-801诱导的自发活动是精神分裂症模
型评定的重要指标。PPI：在25min的测试过程中，实验动物接受惊反射刺激、前脉冲刺激、前脉冲联合惊反射刺激以及恒定背景噪声（65dB）的无刺激实验4种类型。惊反射刺激为120dB，持续40ms的白噪声；前脉冲刺激为70、75、80以及85dB的白噪声。实验开始后，给予每只动物5min的适应时间，之后每种类型的实验以假随机的顺序出现8次，每个实验间的间隔为15-25ms 。
尤鹏升精神分裂症“二次打击”小鼠模型的建立与评价781
first liit vveaiihig GD9.5PND21 Hi
Poly I:C
[10mg/kg f i.pj
or
Saline
10.9%NaCLi.p]
cond hit j\____\
PND21/PND42\1PND56
1/l/
behavioral asssment: Poly I:C
“贏i.pj
I)•prepul iuJubiiioii(PPI)
or.locomotor reactions to
(
Saline
[0.9«A NaCl s i.p]
dizocilpin亡(MK-801)
V_____________________________丿
The first hit was compod of maternal immune activation by poly I：C on gestation day9.5;control mother received corre-sponding vehicle solution；offepruig bom to Poly I:C-treated(MIA)or vehicle-treated(CON)mothers were weaned on postnatal day21；then they were expod to poly I：C or saline on gestation21or42as the cond hit；behavioral asssment took place when the animals reached postnatal day56
图1小鼠“二次打击''模型示意图
Fig1Schematic reprentation of the two-hit model
MK・801诱导的自发活动：将实验小鼠放在矿场检测箱（40cmX40cmX35cm），追踪30min内小鼠的自发活动轨迹。取出小鼠，按5mg/kg的剂量腹腔注射M K-801（0.025Rg/mL）后放回检测箱，追踪60min内小鼠的活动轨迹。
1.3统计学分析
采用SPSS25*0和Graphpad Prism&0软件进行统计学分析，实验数据以均值土标准差（无土s）表示。小鼠海马和皮层细胞因子的mRNA表达情况，以相对于对照组的相对倍数表示，采用非配对t检验进行比较。PPI检测的前脉冲反射抑制率、MK-801诱导的自发活动采用重复测量的方差分析比较组间差异。
2结果
2.1poly I：C诱导中枢及系统炎性反应
注射poly I：G能够诱导机体产生强烈的系统及中枢炎性反应（图2）。注射后3h血清中IL・6、IL-10以及TNF-a均显著升高（P<0.001）,12h后细胞因子的水平基本恢复正常,24h后血清中的细胞因子水平完全恢复正常（图2A~C），炎性反应消失。脑组织中IL-6和IL-ip的mRNA表达水平在poly I：C注射3h后两种细胞因子的mRNA表达水平均显著上升，12h后基本恢复正常水平，与血清中的变化趋势相同（图2D~H）O在海马组织中,IL-6和IL-lp的mRNA表达水平分别为对照组的3.5倍和3.4倍（图2D,E）；在皮层中，IL-6的mRNA表达水平为对照组的6.6倍（图2G），而IL-10没有显著变化（图2H）。大脑中TNF-a mRNA表达水平在poly I：C注射12h之内一直处于升高的状态，直到24h 后才恢复正常（图2F,I）。
2.2MIA组中雌性比雄性表现出更强的精神分裂症表型
MIA组小鼠在前脉冲声强为75.80以及85dB 时，惊反射抑制率较对照组显著降低（图3A,B）o MIA组小鼠注射MK-801后自发活动较对照组明显增加，雄鼠在80.85以及90min时显著升高；雌鼠在55~90min内运动水平显著升高（图3C,D）。
在4种不同的前脉冲声强刺激下，雄性对照组小鼠的惊反射抑制率较雌性小鼠没有明显差异，但在前脉冲声强为80.85dB时,MIA组雌性小鼠的前脉冲抑制率较雄性小鼠显著降低（图3A）。MK-801的结果也发现，对照组注射MK-801后，雌性小鼠和雄性小鼠间自发活动没有明显差异，但是MIA组小鼠60~75min时，雌性小鼠的自发活动明显高于雄性小鼠（图3C）。
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基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine
2021.41(6)
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Pregnant mice were expod to poly I ：C or control vehicle (saline) solution on gestation 9. 5, and the inflammatory cyto
kines in plasma ( A-C) , inflammatory mRNA transcripts in hippocampus ( D-F) and cerebral cortex ( G-I) were
measured 3,12 and 24 hours post-treatment;plasma ： A. IL-6； B. IL-10； C. TNF-a ； hippocampus : D. IL-6； E. IL-lp ； F. TNF-a ； cerebral cortex : G. IL-6, H. IL-10, I. TNF-a ； *P < 0. 05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with
control group
图2 polyI :C 注射后血清和大脑中炎性细胞因子表达变化
匹 2 Plasma qrtokiiie and brain cytokiiie mRNA levels after treated with poly I ：C(x±s, n=3)
2.3 poly I ：C 的“二次打击”减弱MIA 小鼠的精
神分裂症表型
在雄性小鼠中,MIA 组小鼠前脉冲抑制率明显
降低，青春期单次注射poly I ：C 的小鼠在前脉冲声 强为80.85 dB 时，其惊反射抑制率较对照组也显著
降低（图4A ），而成年早期注射Poly I ：C 的雄鼠则
无明显变化（图4B ）。产前感染联合青春期炎性的 “二次打击”之后，小鼠的前脉冲抑制率与对照组相
比反而没有明显变化（图4A,B ）。雌性小鼠的实验
结果与雄性小鼠基本一致,MIA 组小鼠以及青春期 感染的小鼠在前脉冲声强为75.80 dB 时，其惊反射 抑制率较对照组均具有显著差异（图4C ）。当青春
期受到“二次打击”后，小鼠在70、85 dB 处的惊反射 抑制率较对照组显著降低（图4C ）。成年早期的
“二次打击”使小鼠在70、80、85 dB 时的惊反射抑制 率显著下降（图4D ），但也没有孕期感染单次打击
造成的表型明显。
3讨论
流行病学和动物模型表明孕期感染和青春期的
不良事件均是精神分裂症的高危风险因素⑻。本 实验通过单次或两次注射poly I ：C 建立精神分裂症 的“二次打击”小鼠模型，发现孕期感染和青春期或
成年早期炎性的联合打击并不能加剧小鼠精神分裂
尤鹏升 精神分裂症“二次打击”小鼠模型的建立与评价
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□ saliiiesaliiie(male)□ saline-saline(female)
■ PIC-saliiie(niale)
□ PIC-saline (fauale)
u和田玉的鉴别方法
<u s =d 2J d l =Q <J J <u d
4
.3
<
o
o
+5dB
+10 dB +15 dB prepul intensity
"
uppnsdlLlIE
qj P J E S
望儿山)
•
o
o
20□ salii i e-saliiie{i i iale)■ PIC-saline(niale)
□ salinc-salinc{fcmalc)
■ PlC-saliie^nale)
male
female
B
A
504(J
越南春节30
2
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1 2 3 4 5
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
5 min bins
c
80
T
步战车20
salinc-salinc(]Tialc)
■ PIC-saliiie(niaIe)□ saliiic-saliic(lcnialc)■ PIC-saline (faiiale)
male
female
o
u .>=q
Jud PQAQ1U
mnnsip
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w p y d o u l
UE9UI
o
D
A. nsorimotor gating as assd by PPI of the acoustic startle reflex ； PPI as a function of increasing prepul intensities (dB ahove background of 65 dB) ； *P <0.05, **P<0.
01, ***P<0.001 compared with male control ( saline-saline )；
护<0. 05,
< 0.01, < 0.001 compared with female control ( saline-saline ) ； B. startle amplitude in 120 dB ;
C. locomotor reaction to the non-competitive NMD A R receptor antagonist dizocilpine ； the line plot showed the distance
moved in an open field arena to initial non treatment and suhquent MK-801 treatment as a function of successive 5-min
bins ；坐<0.05 reflecting the significant difference between male and female group ; D. mean distance moved in the open field after administration of 陋K-801
图3母体免疫激活后小鼠具有精神分裂症样的行为改变
Fig 3 Behavioral chais of maternal immune activation on prepul inhibition and locomotor
reactions to dizocilpine （x±f, n=6~10）
症的表型，反而有一定的缓解作用，表明两者间不存 在累加效应。
类似的现象也有报道，青春期单只饲养的小鼠 会表现出过度活跃、海马和皮层细胞因子水平升高、
记忆和学习功能受损等表型，而妊娠期注射poly I ：
C 再单只饲养的小鼠非但没有加重上述表型，反而
巴尔达斯缓解了因为隔离而产生的一系列行为和细胞因子变 化⑼。此外，通过产前免疫应激（妊娠第9天单次
注射poly I ：C ）联合青春期压力应激（电足、束缚、水
剥夺以及重复更换笼具）建立精神分裂症的“二次
打击”模型，发现孕期感染增加了子代对压力应激 变化的脆弱性，也就是说母体免疫激活与青春期压 力应激会产生协同的病理效应⑺。同时也有研究
发现青春期的压力应激并不能加剧孕期感染造成的
行为变化［⑹。“二次打击”的研究结果如此大相径 庭，究其原因可能是由于孕期感染的时间、剂量以及 第二次打击的方式不同造成的。现有研究中，孕期 感染的时间从GD 9-17
不等，部分研究采用多种社
