子宫内膜腺癌组织中igfbp-rp1基因的甲基化状态及其mr-na、蛋白表达水平的检测

更新时间:2023-06-01 21:39:59 阅读: 评论:0

(4):356
[6]RossiS,HallettM,RossiniPM,etal.Safety,ethicalcon-
siderations,andapplicationguidelinesfortheuseoftran-scranialmagneticstimulationinclinicalpracticeandre-search[J].ClinNeurophysiol,2009,120(12):2008
父母的爱的作文[7]AlemanA.Useofrepetitivetranscranialmagneticstimula-
tionfortreatmentinpsychiatry[J].ClinPsychopharmacolNeurosci,2013,11(2):53
[8]EvansGJ,CousinMA.Tyrosinephosphorylationofsynapto-
physininsynapticvesiclerecycling[J].BiochemSo
cTrans,2005,33(Pt6):1350[9]WillnerP,TowellA,SampsonD,etal.Reductionofsu-
crosepreferencebychronicunpredictablemildstress,anditsrestorationbyatricyclicantidepressant[J].Psychophar-macology(Berl),1987,93(3):358
[10]BrightwellJJ,GallagherM,ColomboPJ.Hippocampal
CREB1butnotCREB2isdecreasedinagedratswithspatialmemoryimpairments[J].NeurobiolLearnMem,2004,81(1):19
[11]AhmedZ,WieraszkoA.Modulationoflearningandhipp-
ocampal,neuronalplasticitybyrepetitivetransc
ranialmag-neticstimulation(rTMS)[J].Bioelectromagnetics,2006,27(4):288
[12]TanT,XieJ,LiuT,etal.Low-frequency(1Hz)repetitive
transcranialmagneticstimulation(rTMS)reversesAβ(1-
42)-mediatedmemorydeficitsinrats[J].ExpGerontol,2013,48(8):786
[13]LinJY,PengB,YangZW,etal.Numberofsynapsesin-
creasedintheratspinaldorsalHornaftersciaticnervetransection:astereologicalstudy[J].BrainResBull,2011,84(6):430
[14]KimJJ,DiamondDM.Thestressedhippocampus,s
ynaptic
plasticityandlostmemories[J].NatRevNeurosci,2002,3(6):453
[15]ThomeJ,PesoldB,BaaderM,etal.Stressdifferentially
regulatessynaptophysinandsynaptotagminexpressioninhippocampus[J].BoilPsychiatry,2001,50(10):809
治疗血栓最好的方法[16]SchmittU,TanimotoN,SeeligerM,etal.Detectionofbe-
havioralalterationsandlearningdeficitsinmicelackingsynaptophysin[J].Neuroscience,2009,162(2):234[17]宿宝贵,潘三强,韩辉,等.大鼠海马结构在空间辨别性
学习记忆时突触素表达的变化[J].中国病理生理杂志,2000,16(5):421
[18]SzeCI,TroncosoJC,KawasC,etal.Lossofthepresynaptic
vesicleproteinsynaptophysininhippocampuscorrelateswithcognitivedeclineinAlzheimerdisease[J].JNeuro-
patholExpNeurol,1997,56(8):933
(2014-11-20收稿 责任编辑王 曼)
doi :10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.014
倡河南省卫生科技创新型人才工程基金资助项目 豫卫科[2010]52号
子宫内膜腺癌组织中IGFBP -rP 1基因的甲基化状态及其mR -NA 、蛋白表达水平的检测倡
郭瑞霞△
,范丽君,李艳敏
河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州450052
△女,1972年3月生,博士,主任医师,教授,研究方向:妇科肿瘤,E-mail:grx0322@sohu.com
关键词 子宫内膜腺癌;胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1;DNA甲基化中图分类号 R737.33
摘要 目的:探讨子宫内膜腺癌组织中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)基因的甲基化状态及其与IGFBP-rP1mRNA、蛋白表达之间的关系。方法:采用甲基化特异性PCR检测45例子宫内膜腺癌、30例子宫内膜单纯性增生和30例子宫内膜不典型增生组织中IGFBP-rP1基因启动子区和第一外显子区CpG岛的甲基化状态;采用实时荧光定量PCR和免疫组化SP法分别检测上述3种组织中IGFBP-rP1mRNA和蛋白的表达。结果:子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1基因在启动子区的甲基化率高于其在第一外显子区的甲基化率(χ2
=6.429,P =0.011)。子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1基因在启动子区的甲基化率低于子宫内膜不典型增生组织和单纯性增生组织(F =14.659,P =0.001)。子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1mRNA和蛋白的表达均高于子宫内膜不典型增生组织和单纯性
美卡狗增生组织(F =8.619、χ2
=23.611,P 均<0.05);在启动子区发生IGFBP-rP1基因甲基化的子宫内
膜腺癌组织中,其mRNA的表达水平低于未甲基化组(t=4.758,P=0.001),其蛋白的表达与甲基化状态呈负关联(rP=-0.625,P<0.001)。结论:子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1基因甲基化主要发生在启动子区,且呈低甲基化状态;IGFBP-rP1启动子区的低甲基化状态可能是IGFBP-rP1基因在子宫内膜腺癌组织中高表达的调控机制之一。
DetectionofmethylationofIGFBP-rP1geneandrelationshipwithitsmR-NAandproteinexpressionsinendometrialadenocarcinomatissue
GUO Ruixia,FAN Lijun,LI Yanmin
Key-Disciplines Laboratory of Clinical-Medicine of Henan,Zhengzhou450052
Key words uterineendometrialadenocarcinoma;insulinlikegrowthfactorbindingprotein-relatedprotein1;DNAmethylation
Abstract Aim:Toinvestigatethemethylationofinsulinlikegrowthfactorbindingprotein-relatedprotein1(IGFBP-rP1)geneanditsrelationshipwiththeexpressionsofIGFBP-rP1mRNAandproteininendometrialadenocarcinomatissue.Methods:Methylation-specificPCRwasusedtodetectthemethylationstatusofIGFBP-rP1geneinthepromoterregionandthefirstexonregionin45casesofendometrialadenocarcinoma,30casesofendometrialatypicalhyperplasia,and30casesofsimpleendometrialhyperplasiatissue,andquantitativeReal-timePCRandimmunohistochemicalSPmethodwererespectivelyusedtodetectthemRNAandproteinexpressionsofIGFBP-rP1.Results:ThemethylationrateofIGFBP-rP1geneinthepromoterregionwashigherthanthatinthefirstexonregionintheendometrialadenocarcinomatissue(χ2=6.429,P=0.011).ThemethylationrateofIGFBP-rP1gene
爆竹的来历inthepromoterregionofendometrialadenocarcinomatissuewassignificantlylowerthanthoseinendometrialatypicalhyperplasiaandsimpleendometrialhyperplasiatissue(F=14.659,P=0.001).ThemRNAandproteinexpressionsofIGFBP-rP1geneinendometrialadenocarcinomatissuewerehigherthanthoseinendometrialatypicalhyperplasiaandsimpleendometrialhyperplasiatissue(F=8.619,χ2=23.611,P<0.05).TheexpressionofIGFBP-rP1mRNAintheendometrialadenocarcinomatissuewiththepromotermethylationwaslowerthanthatwithout(t=4.758,P=0.001);theexpressionofIGFBP-rP1proteinintheendometrialadenocarcinomatissuewiththepromotermethylationwasnegativelyassociatedwiththepromotermethylation(rP=-0.625,P<0.001).Conclusion:ThemethylationofIGFBP-rP1genemainlyexistsinthepromoterregionofendometrialadenocarcinomatissu
einalowmethylationstatus;thelowmethylationstatusinthepromoterregionofIGFBP-rP1maybeoneoftheregulatorymechanismsofthehighexpressionofIGFBP-rP1geneinendometrialadenocarcinoma.
  子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见,是女性生殖道三大恶性肿瘤之一,近年来其发病率在世界范围内呈上升趋势[1]。胰岛素样生长因子结合蛋白(insulinlikegrowthfactorbindingprotein,IG-
FBP)是胰岛素样生长因子系统(insulin-likegrowthfactorsystem,IGFs)中的重要成员,而胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulinlikegrowthfactorbindingprotein-relatedprotein1,IGFBP-rP1)因其与胰岛素的强结合能力而受到广泛关注[2-3]。作者所在课题组的前期研究[4-5]表明:IGFBP-rP1与胰岛素抵抗有关,参与了子宫内膜腺癌的发生发展,但其表达调控机制不明。DNA甲基化是目前研究基因表达调控的热点,在对结肠癌、贲门癌的研究[6-7]中发现IGFBP-rP1基因的异常甲基化状态与其表达调控有关。该研究应用甲基化特异性PCR检测子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1基因CpG岛的甲基化状态,同时采用实
时荧光定量PCR和免疫组化SP法分别检测子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1基因mR-
NA和蛋白的表达,探究IGFBP-rP1基因甲基化状态与其mRNA和蛋白表达的关系,进一步阐明子宫内膜腺癌发生的分子生物学机制。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选取郑州大学第一附属医院2013年10月至2014年5月因子宫内膜腺癌切除子宫的内膜腺癌标本45例,均经病理证实且患者术前均未接受放化疗,临床资料完整。收集同期子宫内膜不典型增生和子宫内膜单纯性增生的内膜标本各30例为对照。以上标本的采取均获得患者知情同意。因新鲜组织标本量所限,蛋白表达的研究选用子宫内膜腺癌组织蜡块,由郑州大学第一附属医院病理科提供。台湾五月天
1.2 试剂 甲基化试剂盒购自美国ZYMORe-search公司,DNA提取试剂盒、Trizol试剂、免疫组化SP试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司,甲基化引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。实时荧光定量PCR试剂盒、逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司,Taq酶、qRT-PCR引物及内参购自南京诺唯赞生物科技有限公司。兔抗人IGFBP-rP1多克隆抗体购自美国Abcam公司。1.3 甲基化检测
1.3.1 CpG岛的预测 运用在线软件MethPrimer预测IGFBP-rP1基因5’端CpG岛的情况,结果显示IGFBP-rP1基因5’端有两个CpG岛存在,这两个CpG岛跨越了启动子区和第一外显子区,故而选取启动子区和第一外显子区进行分析。1.3.2 IGFBP-rP1基因甲基化状态检测 用DNA提取试剂盒提取组织DNA,紫外分光光度仪检测DNA含量和纯度,DNAMethylation-Goldkit(购自美国ZYMOResearch公司)进行甲基化修饰。然后进行PCR扩增,引物序列、退火温度及扩增产物长度见表1。反应体系(50μL):2×TaqMasterMix25μL,上、下游引物(10μmol/L)各2μL,模板DNA1μg,其余用RNase-free水补足。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,退火30s,72℃延伸1min,35个循环;最终72℃彻底延伸7min。扩增产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳,结果拍照保存。阴性对照采用灭菌蒸馏水取代DNA进行PCR扩增。不同组织中IGFBP-rP1基因的甲基化状态有3种情况:完全甲基化、非甲基化和半甲基化,其中完全甲基化和半甲基化均计为甲基化。
表1 IGFBP-rP1基因甲基化引物
类型引物序列退火温度/℃扩增产物长度/bp启动子区
甲基化F:5摧-AGAAATTAGAGGGTGGAAGAGTCGT-3摧
54173
R:5摧-CTACTAACGTCGAAAAATAAACGAA-3摧
未甲基化F:5摧-AGAAATTAGAGGGTGGAAGAGTTG-3摧
50173
R:5摧-CTACTAACATCAAAAAATAAACAAA-3摧
大班英语教案第一外显子区
甲基化F:5摧-TTGGGCGAGATTCGCGACGC-3摧
60273
R:5摧-GACCCTCTAACTAACGACGCG-3摧
未甲基化F:5摧-TTGTTGGGTGAGATTTGTGATGT-3摧
54278
R:5摧-TCAACCCTCTAACTAACAACACA-3摧
F:上游引物;R:下游引物。
1.4 IGFBP-rP1mRNA的表达检测 应用Trizol试剂提取组织RNA,紫外分光光度仪检测RNA含量和纯度,逆转录试剂盒将RNA转为cDNA,所得cDNA稀释10倍备用。qRT-PCR:反应体系(20μL):SYBRGreenReal-timePCRMasterMix10μL,上、下游引物(1.0μmol/L)各0.8μL,稀释后的cD-NA2μL,蒸馏水补足。反应条件:95℃60s;95℃15s,60℃15s,72℃45s,共40个循环。试验重复3次,取平均值。采用2-ΔΔCt法计算IGFBP-rP1mR-NA的表达水平。
1.5 IGFBP-rP1蛋白的表达检测 蜡块依次经烘烤,二甲苯、梯度乙醇脱蜡、水化,抗原修复后按照免疫组化SP试剂盒步骤操作。一抗兔抗人IGFBP-rP1多克隆抗体按1砄50稀释后使用,以PBS代替一抗作为阴性对照。细胞中出现明显的棕色颗粒即为阳性,用双盲法阅片和判断结果。染色强度分为无、弱、中、强4级,分别计为0、1、2、3分;视野内阳性细胞百分比按0%~、10%~、26%~、51%~100%分4级,分别计为0、1、2、3分。两项评分的乘积为0分判为阴性,≥1分则判为阳性。
1.6 统计学处理 采用SPSS17.0处理数据。采用χ2检验比较3种组织中IGFBP-r
P1基因启动子区和第一外显子区的甲基化率以及3种组织中IG-FBP-rP1蛋白的阳性表达率,采用单因素方差分析比较3种组织中IGFBP-rP1mRNA表达水平的差异,两两比较采用LSD-t检验。采用两独立样本的t 检验比较不同IGFBP-rP1甲基化状态的子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1mRNA的表达水平,采用Pear-son列联系数分析子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1基因的甲基化状态与其蛋白表达的关系。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 不同组织IGFBP-rP1基因启动子区和第一外显子区的甲基化水平 见图1、2,表1。子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1基因在启动子区的甲基化率高于其在第一外显子区的甲基化率(χ2=6.429,P=0.
011)。
图1 IGFBP-rP1基因启动子区的甲基化状态M:甲基化;U:非甲基化;1:完全甲基化状态;2:半甲基化状态;3:非甲基化状态;4:空白对照。
图2 IGFBP -rP 1基因第一外显子区的甲基化状态
M:甲基化;U:非甲基化;1:完全甲基化状态;2:半甲基化状态;3:非甲基化状态;4:空白对照。
表1 不同组织IGFBP -rP 1基因启
动子区和第一外显子区的甲基化率比较例(%)
组织类型
n 启动子区第一外显子区子宫内膜单纯性增生3021(70.0)8(26.7)子宫内膜不典型增生
3020(66.7)7(23.3)
子宫内膜腺癌
45
15(33.3)
早春红玉
7(11.1)χ214.6591.485P
0.0010.476
倡:与其他两种组织相比,P <0.017。2.2 不同组织中IGFBP -rP 1mRNA 和蛋白的表达情况 见表2、图3。IGFBP-rP1蛋白主要表达于胞质,但在子宫内膜腺癌胞核中也可见
其表达;整体来看子宫内膜腺癌组织中棕染细胞多,且染色深。由表2可知,子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1mRNA的表达水平和蛋白的阳性表达率高于子宫内膜不典型增生组织和单纯性增生组织。
表2 不同组织中
IGFBP -rP 1mRNA 和蛋白的表达情况组织类型n mRNA蛋白阳性
表达例数(%)子宫内膜单纯性增生301.276±0.1697(23.3)子宫内膜不典型增生
301.198±0.3015(16.7)
子宫内膜腺癌
45
2.765±0.238
30(66.7)倡
F /χ
8.61923.611P
0.004
<0.001
倡:与其他两种组织相比,P <0.
017。
图3 不同组织中IGFBP -rP 1蛋白的表达(SP,×400)
A:子宫内膜腺癌组织;B:子宫内膜不典型增生组织;C:子宫内膜单纯性增生组织。
2.3 子宫内膜腺癌组织中IGFBP -rP 1基因的甲基化状态与其mRNA 和蛋白表达的关系 见表3、4。由表3、4可知,在启动子区发生IGFBP-rP1基因甲基化的子宫内膜腺癌组织中,其mRNA的表达水平低于未甲基化组;其蛋白的表达与甲基化状态呈负关联。
表3 子宫内膜腺癌组织中IGFBP -rP 1基因的甲基化状态与其mRNA 表达的关系(n =45)不同部位的甲基化n
mRNA
t
P
启动子区-303.246±0.1464.758
0.001
+15
1.015±0.032
第一外显子区-382.234±0.1261.345
0.261
2.875±0.032
表4 子宫内膜腺癌组织中IGFBP -rP 1基因的甲基化状态与其蛋白表达的关系(n =45)不同部位的甲基化蛋白/例-+r P
P 启动子区
-2280.625
<0.001
132第一外显子区-11270.2120.146
3 讨论
  IGFs是研究胰岛素抵抗的热点,是一个由配体(IGF-1、IGF-2),细胞表面受体(IGF-1R、IGF-2R),
胰岛素受体,IGFBP以及IGFBP蛋白酶组成的复杂网络。IGFBP-rP1是IGFBPs家族中重要的一员,因其与胰岛素的高结合力而得到广泛关注。研究表
明:此基因在胶质瘤[8]中表现为促癌作用,而在肝细胞癌[9]、胃癌[10]、贲门癌[7]中则表现为抑癌作用。该研究发现,子宫内膜腺癌组织中IGFBP-rP1基因
mRNA和蛋白的表达量均高于子宫内膜单纯性增生组织和不典型增生组织,充当促癌基因的角色。
遗传学改变已不足以解释肿瘤的发生发展过程,而更多地需依赖表观遗传学改变给予进一步阐释。DNA甲基化作为化学修饰的一种形式,能在不改变核苷酸序列的前提下使其遗传表现发生变化,是表观遗传学的重要内容,也是目前研究的热点。DNA的甲基化大多发生于CpG二核苷酸的胞嘧啶上。在哺乳动物中CpG以两种形式存在:一种是分散于DNA序列,另一种呈现高度聚集状态,称之为CpG岛,主要位于基因的启动子区和外显子区[11]。DNA的异常甲基化包括高甲基化及低甲基化两种状态。DNA的高甲基化是许多抑癌基因表达丢失的重要途径之一。在正常组织里,CpG岛是非甲基化的,一旦发生甲基化,会影响相应基因的转录调控过程,进而抑制基因的表达。DNA的低甲基化是指分布于正常组织中的甲基化位点发生去甲基化,从而引起基因表达的改变。该研究结果表明:在子宫内膜腺癌组织中,IGFBP-rP1基因甲基化主要发生在启动子区,且呈低甲基化状态。基因的低甲基化存在于多种肿瘤之中,最早是由Feinberg等[12]发现,而后陆续发现多种基因的低甲基化状态,且甲基化的区域也不尽相同,如c-erbB-2基因[13]启动子区的低甲基化状态,SNCG基因[14]第一外显子区的低甲基化状态,Ras基因[15]第一内含子区的低甲基化状态。该研究结果显示,子宫内膜腺癌组织中IG-FBP-rP1mRNA的表达水平和蛋白的阳性表达率高于子宫内膜不典型增生组织和单纯性增生组织,在启动子区发生IGFBP-rP1基因甲基化的子宫内膜腺癌组织中,其mRNA的表达水平低于未甲基化组;其蛋白的表达与甲基化状态呈负关联,提示此基因启动子区的低甲基化状态是其在子宫内膜腺癌组织中高表达的调控机制之一。目前认为DNA低甲基化在肿瘤发生发展中的机制可能为:低甲基
化或去甲基化会活化某些原癌基因;低甲基化使染色质和基因组不稳定,突变频率增加,但具体机制有待于进一步探究。DNA甲基化是可逆的化学修饰过程,这就提示着逆转异常甲基化状态可抑制肿瘤的发生发展,为临床上疾病的诊治提供了新的思路。
参考文献
[1]ZhouXC,DowdySC,PodratzKC,etal.Epigeneticconsid-
erationsforendometrialcancerprevention,diagnosisandtreatment[J].GynecolOncol,2007,107(1):143
[2]YamanakaY,WilsonEM,RosenfeldRG,etal.Inhibitionofinsulinreceptoractivationbyinsulin-likegrowthfactorbindingproteins[J].JBiolChem,1997,272(49):30729[3]邝建,杨华章,董晖,等.胰岛素样生长因子及其结合蛋白与2型糖尿病肾脏病变相关性研究[J].中国实用内
科杂志,2006,26(6):433
[4]郭瑞霞,石学敏,张晓芬,等.IGFBP-7在子宫内膜腺癌中的表达及其意义[J].现代妇产科进展,2014,23(1):
18
[5]郭瑞霞,张晓芬,石学敏,等.上调胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1对子宫内膜癌细胞系HEC-1A生物
学功能的影响[J].中国妇幼保健,2014,29(14):2260[6]LinJ,LaiM,HuangQ,etal.MethylationpatternsofIG-FBP7incoloncancercelllinesareassociatedwithlevelsofgeneexpression[J].JPathol,2007,212(1):83
[7]沈素朋,董稚明,郭炜,等.人贲门腺癌组织中IGFBP7基因的甲基化状态[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2012,
19(6):632
[8]JiangW,XiangC,CazacuS,etal.Insulin-likegrowthfactorbindingprotein7mediatesgliomacellg
rowthandmigration
[J].Neoplasia,2008,10(12):1335
[9]ChenD,YooBK,SanthekadurPK,etal.Insulin-likegrowthfactor-bindingprotein-7functionsasapotentialtumorsup-pressorinhepatocellularcarcinoma[J].ClinCancerRes,
2011,17(21):6693
[10]贺德志,李建生,彭俏,等.胰岛素样生长因子结合蛋白7在胃癌中的表达及其临床意义[J].中华消化杂志,
2012,32(8):559
[11]EstellerM,HermanJG.Cancerasanepigeneticdisease:DNAmethylationandchromatinalterationsinhumantumours[J].JPathol,2002,196(1):1
徐字组词
[12]FeinbergAP,VogelsteinB.Hypomethylationdistinguishesgenesofsomehumancancersfromtheirnormalcounter-parts[J].Nature,1983,301(5895):89
[13]HattoriM,SakamotoH,SatohK,etal.DNAdemethylaseisexpressedinovariancancersandtheexpressioncorrelateswithdemethylationofCpGsitesinthepromoterregionofc-erbB-2andsurvivingenes[J].CancerLett,2001,169(2):155[14]LiuH,LiuW,WuY,etal.Lossofepigeneticcontrolofsy-nuclein-gammageneasamolecularindicatorofmetastasisinawiderangeofhumancancers[J].CancerRes,2005,
65(17):7635
[15]NishigakiM,AoyagiK,DanjohI,etal.Discoveryofaber-rantexpressionofR-RASbycancer-linked
DNAhypometh-ylationingastriccancerusingmicroarrays[J].CancerRes,2005,65(6):2115
(2015-01-05收稿 责任编辑徐春燕)

本文发布于:2023-06-01 21:39:59,感谢您对本站的认可!

本文链接:https://www.wtabcd.cn/fanwen/fan/89/963213.html

版权声明:本站内容均来自互联网,仅供演示用,请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系,我们将在24小时内删除。

标签:内膜   表达   组织   腺癌   蛋白   状态   研究
相关文章
留言与评论(共有 0 条评论)
   
验证码:
推荐文章
排行榜
Copyright ©2019-2022 Comsenz Inc.Powered by © 专利检索| 网站地图