（４）：３５６
［６］ＲｏｓｓｉＳ，ＨａｌｌｅｔｔＭ，ＲｏｓｓｉｎｉＰＭ，ｅｔａｌ．Ｓａｆｅｔｙ，ｅｔｈｉｃａｌｃｏｎ－
ｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ，ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｕｓｅｏｆｔｒａｎ－ｓｃｒａｎｉａｌｍａｇｎｅｔｉｃｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄｒｅ－ｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．ＣｌｉｎＮｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，１２０（１２）：２００８
父母的爱的作文［７］ＡｌｅｍａｎＡ．Ｕｓｅｏｆｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌｍａｇｎｅｔｉｃｓｔｉｍｕｌａ－
ｔｉｏｎｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ［Ｊ］．ＣｌｉｎＰｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１３，１１（２）：５３
［８］ＥｖａｎｓＧＪ，ＣｏｕｓｉｎＭＡ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｓｙｎａｐｔｏ－
ｐｈｙｓｉｎｉｎｓｙｎａｐｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｒｅｃｙｃｌｉｎｇ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＳｏ
ｃＴｒａｎｓ，２００５，３３（Ｐｔ６）：１３５０［９］ＷｉｌｌｎｅｒＰ，ＴｏｗｅｌｌＡ，ＳａｍｐｓｏｎＤ，ｅｔａｌ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｕ－
ｃｒｏｓｅｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｂｙｃｈｒｏｎｉｃｕｎｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅｍｉｌｄｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄｉｔｓｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｂｙａｔｒｉｃｙｃｌｉｃａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ［Ｊ］．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒ－ｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ），１９８７，９３（３）：３５８
［１０］ＢｒｉｇｈｔｗｅｌｌＪＪ，ＧａｌｌａｇｈｅｒＭ，ＣｏｌｏｍｂｏＰＪ．Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ
ＣＲＥＢ１ｂｕｔｎｏｔＣＲＥＢ２ｉｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎａｇｅｄｒａｔｓｗｉｔｈｓｐａｔｉａｌｍｅｍｏｒｙｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ［Ｊ］．ＮｅｕｒｏｂｉｏｌＬｅａｒｎＭｅｍ，２００４，８１（１）：１９
［１１］ＡｈｍｅｄＺ，ＷｉｅｒａｓｚｋｏＡ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｈｉｐｐ－
ｏｃａｍｐａｌ，ｎｅｕｒｏｎａｌｐｌａｓｔｉｃｉｔｙｂｙｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｃ
ｒａｎｉａｌｍａｇ－ｎｅｔｉｃｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（ｒＴＭＳ）［Ｊ］．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ，２００６，２７（４）：２８８
［１２］ＴａｎＴ，ＸｉｅＪ，ＬｉｕＴ，ｅｔａｌ．Ｌｏｗ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（１Ｈｚ）ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ
ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌｍａｇｎｅｔｉｃｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（ｒＴＭＳ）ｒｅｖｅｒｓｅｓＡβ（１－
４２）－ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｍｏｒｙｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎｒａｔｓ［Ｊ］．ＥｘｐＧｅｒｏｎｔｏｌ，２０１３，４８（８）：７８６
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ｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｒａｔｓｐｉｎａｌｄｏｒｓａｌＨｏｒｎａｆｔｅｒｓｃｉａｔｉｃｎｅｒｖｅｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ：ａｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｙ［Ｊ］．ＢｒａｉｎＲｅｓＢｕｌｌ，２０１１，８４（６）：４３０
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ｙｎａｐｔｉｃ
ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙａｎｄｌｏｓｔｍｅｍｏｒｉｅｓ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＮｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，３（６）：４５３
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ｒｅｇｕｌａｔｅｓｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎａｎｄｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ［Ｊ］．ＢｏｉｌＰｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２００１，５０（１０）：８０９
治疗血栓最好的方法［１６］ＳｃｈｍｉｔｔＵ，ＴａｎｉｍｏｔｏＮ，ＳｅｅｌｉｇｅｒＭ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｅ－
ｈａｖｉｏｒａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓａｎｄｌｅａｒｎｉｎｇｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎｍｉｃｅｌａｃｋｉｎｇｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１６２（２）：２３４［１７］宿宝贵，潘三强，韩辉，等．大鼠海马结构在空间辨别性
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［１８］ＳｚｅＣＩ，ＴｒｏｎｃｏｓｏＪＣ，ＫａｗａｓＣ，ｅｔａｌ．Ｌｏｓｓｏｆｔｈｅｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ
ｖｅｓｉｃｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｅｃｌｉｎｅｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏ－
ｐａｔｈｏｌＥｘｐＮｅｕｒｏｌ，１９９７，５６（８）：９３３
（２０１４－１１－２０收稿 责任编辑王 曼）
doi ：１０．１３７０５／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－６８２５．２０１５．０６．０１４
倡河南省卫生科技创新型人才工程基金资助项目 豫卫科［２０１０］５２号
子宫内膜腺癌组织中IGFBP －rP １基因的甲基化状态及其mR －NA 、蛋白表达水平的检测倡
郭瑞霞△
，范丽君，李艳敏
河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州４５００５２
△女，１９７２年３月生，博士，主任医师，教授，研究方向：妇科肿瘤，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｒｘ０３２２＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
关键词 子宫内膜腺癌；胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白１；ＤＮＡ甲基化中图分类号 Ｒ７３７．３３
摘要 目的：探讨子宫内膜腺癌组织中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白１（ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１）基因的甲基化状态及其与ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡ、蛋白表达之间的关系。方法：采用甲基化特异性ＰＣＲ检测４５例子宫内膜腺癌、３０例子宫内膜单纯性增生和３０例子宫内膜不典型增生组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因启动子区和第一外显子区ＣｐＧ岛的甲基化状态；采用实时荧光定量ＰＣＲ和免疫组化ＳＰ法分别检测上述３种组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡ和蛋白的表达。结果：子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因在启动子区的甲基化率高于其在第一外显子区的甲基化率（χ２
＝６．４２９，P ＝０．０１１）。子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因在启动子区的甲基化率低于子宫内膜不典型增生组织和单纯性增生组织（F ＝１４．６５９，P ＝０．００１）。子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡ和蛋白的表达均高于子宫内膜不典型增生组织和单纯性
美卡狗增生组织（F ＝８．６１９、χ２
＝２３．６１１，P 均＜０．０５）；在启动子区发生ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因甲基化的子宫内
膜腺癌组织中，其ｍＲＮＡ的表达水平低于未甲基化组（t＝４．７５８，P＝０．００１），其蛋白的表达与甲基化状态呈负关联（rＰ＝－０．６２５，P＜０．００１）。结论：子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因甲基化主要发生在启动子区，且呈低甲基化状态；ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１启动子区的低甲基化状态可能是ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因在子宫内膜腺癌组织中高表达的调控机制之一。
ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｇｅｎｅａｎｄｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｉｔｓｍＲ－ＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅ
GUO Ruixia，FAN Lijun，LI Yanmin
Key－Disciplines Laboratory of Clinical－Medicine of Henan，Zhengzhou450052
Key words ｕｔｅｒｉｎｅｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１；ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
Abstract Aim：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１（ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１）ｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅ．Methods：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｇｅｎｅｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎａｎｄｔｈｅｆｉｒｓｔｅｘｏｎｒｅｇｉｏｎｉｎ４５ｃａｓｅｓｏｆｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，３０ｃａｓｅｓｏｆｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｔｙｐｉｃａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ，ａｎｄ３０ｃａｓｅｓｏｆｓｉｍｐｌｅｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＳＰｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１．Results：ＴｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｇｅｎｅｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｅｘｏｎｒｅｇｉｏｎｉｎｔｈｅｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅ（χ２＝６．４２９，P＝０．０１１）．ＴｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｇｅｎｅ
爆竹的来历ｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｔｙｐｉｃａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｓｉｍｐｌｅｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｔｉｓｓｕｅ（F＝１４．６５９，P＝０．００１）．ＴｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｇｅｎｅｉｎｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｔｙｐｉｃａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｓｉｍｐｌｅｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｔｉｓｓｕｅ（F＝８．６１９，χ２＝２３．６１１，P＜０．０５）．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡｉｎｔｈｅｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｗｉｔｈｏｕｔ（t＝４．７５８，P＝０．００１）；ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（rＰ＝－０．６２５，P＜０．００１）．Conclusion：ＴｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｇｅｎｅｍａｉｎｌｙｅｘｉｓｔｓｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕ
ｅｉｎａｌｏｗｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓ；ｔｈｅｌｏｗｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍａｙｂｅｏｎｅｏｆｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｈｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｇｅｎｅｉｎｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见，是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，近年来其发病率在世界范围内呈上升趋势［１］。胰岛素样生长因子结合蛋白（ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＩＧ－
ＦＢＰ）是胰岛素样生长因子系统（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ，ＩＧＦｓ）中的重要成员，而胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白１（ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１，ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１）因其与胰岛素的强结合能力而受到广泛关注［２－３］。作者所在课题组的前期研究［４－５］表明：ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１与胰岛素抵抗有关，参与了子宫内膜腺癌的发生发展，但其表达调控机制不明。ＤＮＡ甲基化是目前研究基因表达调控的热点，在对结肠癌、贲门癌的研究［６－７］中发现ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因的异常甲基化状态与其表达调控有关。该研究应用甲基化特异性ＰＣＲ检测子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因ＣｐＧ岛的甲基化状态，同时采用实
时荧光定量ＰＣＲ和免疫组化ＳＰ法分别检测子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因ｍＲ－
ＮＡ和蛋白的表达，探究ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因甲基化状态与其ｍＲＮＡ和蛋白表达的关系，进一步阐明子宫内膜腺癌发生的分子生物学机制。
１ 对象与方法
１．１ 研究对象 选取郑州大学第一附属医院２０１３年１０月至２０１４年５月因子宫内膜腺癌切除子宫的内膜腺癌标本４５例，均经病理证实且患者术前均未接受放化疗，临床资料完整。收集同期子宫内膜不典型增生和子宫内膜单纯性增生的内膜标本各３０例为对照。以上标本的采取均获得患者知情同意。因新鲜组织标本量所限，蛋白表达的研究选用子宫内膜腺癌组织蜡块，由郑州大学第一附属医院病理科提供。台湾五月天
１．２ 试剂 甲基化试剂盒购自美国ＺＹＭＯＲｅ－ｓｅａｒｃｈ公司，ＤＮＡ提取试剂盒、Ｔｒｉｚｏｌ试剂、免疫组化ＳＰ试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，甲基化引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒、逆转录试剂盒购自日本ＴＯＹＯＢＯ公司，Ｔａｑ酶、ｑＲＴ－ＰＣＲ引物及内参购自南京诺唯赞生物科技有限公司。兔抗人ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１多克隆抗体购自美国Ａｂｃａｍ公司。１．３ 甲基化检测
１．３．１ ＣｐＧ岛的预测 运用在线软件ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ预测ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因５’端ＣｐＧ岛的情况，结果显示ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因５’端有两个ＣｐＧ岛存在，这两个ＣｐＧ岛跨越了启动子区和第一外显子区，故而选取启动子区和第一外显子区进行分析。１．３．２ ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因甲基化状态检测 用ＤＮＡ提取试剂盒提取组织ＤＮＡ，紫外分光光度仪检测ＤＮＡ含量和纯度，ＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄｋｉｔ（购自美国ＺＹＭＯＲｅｓｅａｒｃｈ公司）进行甲基化修饰。然后进行ＰＣＲ扩增，引物序列、退火温度及扩增产物长度见表１。反应体系（５０μＬ）：２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各２μＬ，模板ＤＮＡ１μｇ，其余用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水补足。反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；最终７２℃彻底延伸７ｍｉｎ。扩增产物经２０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，结果拍照保存。阴性对照采用灭菌蒸馏水取代ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。不同组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因的甲基化状态有３种情况：完全甲基化、非甲基化和半甲基化，其中完全甲基化和半甲基化均计为甲基化。
表１ IGFBP－rP１基因甲基化引物
类型引物序列退火温度／℃扩增产物长度／ｂｐ启动子区
甲基化Ｆ：５摧－ＡＧＡＡＡＴＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＣＧＴ－３摧
５４１７３
Ｒ：５摧－ＣＴＡＣＴＡＡＣＧＴＣＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＧＡＡ－３摧
未甲基化Ｆ：５摧－ＡＧＡＡＡＴＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧ－３摧
５０１７３
Ｒ：５摧－ＣＴＡＣＴＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡ－３摧
大班英语教案第一外显子区
甲基化Ｆ：５摧－ＴＴＧＧＧＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＧＡＣＧＣ－３摧
６０２７３
Ｒ：５摧－ＧＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＴＡＡＣＧＡＣＧＣＧ－３摧
未甲基化Ｆ：５摧－ＴＴＧＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＴ－３摧
５４２７８
Ｒ：５摧－ＴＣＡＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＴＡＡＣＡＡＣＡＣＡ－３摧
Ｆ：上游引物；Ｒ：下游引物。
１．４ IGFBP－rP１mRNA的表达检测 应用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取组织ＲＮＡ，紫外分光光度仪检测ＲＮＡ含量和纯度，逆转录试剂盒将ＲＮＡ转为ｃＤＮＡ，所得ｃＤＮＡ稀释１０倍备用。ｑＲＴ－ＰＣＲ：反应体系（２０μＬ）：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ，上、下游引物（１．０μｍｏｌ／Ｌ）各０．８μＬ，稀释后的ｃＤ－ＮＡ２μＬ，蒸馏水补足。反应条件：９５℃６０ｓ；９５℃１５ｓ，６０℃１５ｓ，７２℃４５ｓ，共４０个循环。试验重复３次，取平均值。采用２－ΔΔＣｔ法计算ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲ－ＮＡ的表达水平。
１．５ IGFBP－rP１蛋白的表达检测 蜡块依次经烘烤，二甲苯、梯度乙醇脱蜡、水化，抗原修复后按照免疫组化ＳＰ试剂盒步骤操作。一抗兔抗人ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１多克隆抗体按１砄５０稀释后使用，以ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照。细胞中出现明显的棕色颗粒即为阳性，用双盲法阅片和判断结果。染色强度分为无、弱、中、强４级，分别计为０、１、２、３分；视野内阳性细胞百分比按０％～、１０％～、２６％～、５１％～１００％分４级，分别计为０、１、２、３分。两项评分的乘积为０分判为阴性，≥１分则判为阳性。
１．６ 统计学处理 采用ＳＰＳＳ１７．０处理数据。采用χ２检验比较３种组织中ＩＧＦＢＰ－ｒ
Ｐ１基因启动子区和第一外显子区的甲基化率以及３种组织中ＩＧ－ＦＢＰ－ｒＰ１蛋白的阳性表达率，采用单因素方差分析比较３种组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡ表达水平的差异，两两比较采用ＬＳＤ－t检验。采用两独立样本的t 检验比较不同ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１甲基化状态的子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡ的表达水平，采用Ｐｅａｒ－ｓｏｎ列联系数分析子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因的甲基化状态与其蛋白表达的关系。检验水准α＝０．０５。
２ 结果
２．１ 不同组织IGFBP－rP１基因启动子区和第一外显子区的甲基化水平 见图１、２，表１。子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因在启动子区的甲基化率高于其在第一外显子区的甲基化率（χ２＝６．４２９，P＝０．
０１１）。
图１ IGFBP－rP１基因启动子区的甲基化状态Ｍ：甲基化；Ｕ：非甲基化；１：完全甲基化状态；２：半甲基化状态；３：非甲基化状态；４：空白对照。
图２ IGFBP －rP １基因第一外显子区的甲基化状态
Ｍ：甲基化；Ｕ：非甲基化；１：完全甲基化状态；２：半甲基化状态；３：非甲基化状态；４：空白对照。
表１ 不同组织IGFBP －rP １基因启
动子区和第一外显子区的甲基化率比较例（％）
组织类型
n 启动子区第一外显子区子宫内膜单纯性增生３０２１（７０．０）８（２６．７）子宫内膜不典型增生
３０２０（６６．７）７（２３．３）
子宫内膜腺癌
４５
１５（３３．３）
早春红玉
倡
７（１１．１）χ２１４．６５９１．４８５P
０．００１０．４７６
倡：与其他两种组织相比，P ＜０．０１７。２．２ 不同组织中IGFBP －rP １mRNA 和蛋白的表达情况 见表２、图３。ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１蛋白主要表达于胞质，但在子宫内膜腺癌胞核中也可见
其表达；整体来看子宫内膜腺癌组织中棕染细胞多，且染色深。由表２可知，子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡ的表达水平和蛋白的阳性表达率高于子宫内膜不典型增生组织和单纯性增生组织。
表２ 不同组织中
IGFBP －rP １mRNA 和蛋白的表达情况组织类型n ｍＲＮＡ蛋白阳性
表达例数（％）子宫内膜单纯性增生３０１．２７６±０．１６９７（２３．３）子宫内膜不典型增生
３０１．１９８±０．３０１５（１６．７）
子宫内膜腺癌
４５
２．７６５±０．２３８
倡
３０（６６．７）倡
F ／χ
２
８．６１９２３．６１１P
０．００４
＜０．００１
倡：与其他两种组织相比，P ＜０．
０１７。
图３ 不同组织中IGFBP －rP １蛋白的表达（ＳＰ，×４００）
Ａ：子宫内膜腺癌组织；Ｂ：子宫内膜不典型增生组织；Ｃ：子宫内膜单纯性增生组织。
２．３ 子宫内膜腺癌组织中IGFBP －rP １基因的甲基化状态与其mRNA 和蛋白表达的关系 见表３、４。由表３、４可知，在启动子区发生ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因甲基化的子宫内膜腺癌组织中，其ｍＲＮＡ的表达水平低于未甲基化组；其蛋白的表达与甲基化状态呈负关联。
表３ 子宫内膜腺癌组织中IGFBP －rP １基因的甲基化状态与其mRNA 表达的关系（n ＝４５）不同部位的甲基化n
ｍＲＮＡ
t
P
启动子区－３０３．２４６±０．１４６４．７５８
０．００１
＋１５
１．０１５±０．０３２
第一外显子区－３８２．２３４±０．１２６１．３４５
０．２６１
＋
７
２．８７５±０．０３２
表４ 子宫内膜腺癌组织中IGFBP －rP １基因的甲基化状态与其蛋白表达的关系（n ＝４５）不同部位的甲基化蛋白／例－＋r Ｐ
P 启动子区
－２２８０．６２５
＜０．００１
＋
１３２第一外显子区－１１２７０．２１２０．１４６
＋
４
３
３ 讨论
ＩＧＦｓ是研究胰岛素抵抗的热点，是一个由配体（ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２），细胞表面受体（ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＧＦ－２Ｒ），
胰岛素受体，ＩＧＦＢＰ以及ＩＧＦＢＰ蛋白酶组成的复杂网络。ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１是ＩＧＦＢＰｓ家族中重要的一员，因其与胰岛素的高结合力而得到广泛关注。研究表
明：此基因在胶质瘤［８］中表现为促癌作用，而在肝细胞癌［９］、胃癌［１０］、贲门癌［７］中则表现为抑癌作用。该研究发现，子宫内膜腺癌组织中ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因
ｍＲＮＡ和蛋白的表达量均高于子宫内膜单纯性增生组织和不典型增生组织，充当促癌基因的角色。
遗传学改变已不足以解释肿瘤的发生发展过程，而更多地需依赖表观遗传学改变给予进一步阐释。ＤＮＡ甲基化作为化学修饰的一种形式，能在不改变核苷酸序列的前提下使其遗传表现发生变化，是表观遗传学的重要内容，也是目前研究的热点。ＤＮＡ的甲基化大多发生于ＣｐＧ二核苷酸的胞嘧啶上。在哺乳动物中ＣｐＧ以两种形式存在：一种是分散于ＤＮＡ序列，另一种呈现高度聚集状态，称之为ＣｐＧ岛，主要位于基因的启动子区和外显子区［１１］。ＤＮＡ的异常甲基化包括高甲基化及低甲基化两种状态。ＤＮＡ的高甲基化是许多抑癌基因表达丢失的重要途径之一。在正常组织里，ＣｐＧ岛是非甲基化的，一旦发生甲基化，会影响相应基因的转录调控过程，进而抑制基因的表达。ＤＮＡ的低甲基化是指分布于正常组织中的甲基化位点发生去甲基化，从而引起基因表达的改变。该研究结果表明：在子宫内膜腺癌组织中，ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因甲基化主要发生在启动子区，且呈低甲基化状态。基因的低甲基化存在于多种肿瘤之中，最早是由Ｆｅｉｎｂｅｒｇ等［１２］发现，而后陆续发现多种基因的低甲基化状态，且甲基化的区域也不尽相同，如ｃ－ｅｒｂＢ－２基因［１３］启动子区的低甲基化状态，ＳＮＣＧ基因［１４］第一外显子区的低甲基化状态，Ｒａｓ基因［１５］第一内含子区的低甲基化状态。该研究结果显示，子宫内膜腺癌组织中ＩＧ－ＦＢＰ－ｒＰ１ｍＲＮＡ的表达水平和蛋白的阳性表达率高于子宫内膜不典型增生组织和单纯性增生组织，在启动子区发生ＩＧＦＢＰ－ｒＰ１基因甲基化的子宫内膜腺癌组织中，其ｍＲＮＡ的表达水平低于未甲基化组；其蛋白的表达与甲基化状态呈负关联，提示此基因启动子区的低甲基化状态是其在子宫内膜腺癌组织中高表达的调控机制之一。目前认为ＤＮＡ低甲基化在肿瘤发生发展中的机制可能为：低甲基
化或去甲基化会活化某些原癌基因；低甲基化使染色质和基因组不稳定，突变频率增加，但具体机制有待于进一步探究。ＤＮＡ甲基化是可逆的化学修饰过程，这就提示着逆转异常甲基化状态可抑制肿瘤的发生发展，为临床上疾病的诊治提供了新的思路。
参考文献
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徐字组词
［１２］ＦｅｉｎｂｅｒｇＡＰ，ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎＢ．Ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓｇｅｎｅｓｏｆｓｏｍｅｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓｆｒｏｍｔｈｅｉｒｎｏｒｍａｌｃｏｕｎｔｅｒ－ｐａｒｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８３，３０１（５８９５）：８９
［１３］ＨａｔｔｏｒｉＭ，ＳａｋａｍｏｔｏＨ，ＳａｔｏｈＫ，ｅｔａｌ．ＤＮＡｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒｓａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆＣｐＧｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｃ－ｅｒｂＢ－２ａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ，２００１，１６９（２）：１５５［１４］ＬｉｕＨ，ＬｉｕＷ，ＷｕＹ，ｅｔａｌ．Ｌｏｓｓｏｆｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｓｙ－ｎｕｃｌｅｉｎ－ｇａｍｍａｇｅｎｅａｓａｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎａｗｉｄｅｒａｎｇｅｏｆｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００５，
６５（１７）：７６３５
［１５］ＮｉｓｈｉｇａｋｉＭ，ＡｏｙａｇｉＫ，ＤａｎｊｏｈＩ，ｅｔａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆａｂｅｒ－ｒａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＲ－ＲＡＳｂｙｃａｎｃｅｒ－ｌｉｎｋｅｄ
ＤＮＡｈｙｐｏｍｅｔｈ－ｙｌａｔｉｏｎｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｕｓｉｎｇｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００５，６５（６）：２１１５
（２０１５－０１－０５收稿 责任编辑徐春燕）
