整块石蜡包埋处理颈动脉粥样硬化斑块的方法
曹敬丽; 高培毅; ThomasS.Hatsukami; 赵锡海; 苑纯; MarinaS.Ferguson; 孙杰; 张东; 刘丽; 李子瑞; 王雅杰; 隋滨滨; 沈宓
【期刊名称】《《中国组织工程研究》》
【年(卷),期】2019(023)031
【总页数】5页(P5041-5045)
【关键词】颈动脉粥样硬化斑块; 磁共振成像; 石蜡包埋; 包埋底模; 连续切片; 动脉粥样硬化; 责任斑块; 脑梗死; 稳定斑块; 不稳定斑块
【作 者】曹敬丽; 高培毅; ThomasS.Hatsukami; 赵锡海; 苑纯; MarinaS.Ferguson; 孙杰; 张东; 刘丽; 李子瑞; 王雅杰; 隋滨滨; 沈宓
【作者单位】首都医科大学附属北京天坛医院 国家神经系统疾病临床医学研究中心 北京市 100070; 脑血管病转化医学北京市重点实验室 北京市 100070; 北京市神经外科研究所 北京
市 100070; 美国华盛顿大学 血管成像实验室 美国 华盛顿-西雅图 98195; 清华大学医学院 生物医学影像研究中心 北京市 100084
安家集数
【正文语种】中 文
【中图分类】R447; R741; R318
0 引言 Introduction
传统石蜡包埋方法在日常病理工作中，一直是组织处理的常规方法[1-2]。随着科技的发展和实际工作的需要，病理工作者在石蜡包埋方面现已摸索出了常规石蜡包埋流程，并逐步完善[3-4]，现有的石蜡包埋相关设备比如自动脱水包埋机、石蜡包埋机、冷台，以及各种规格的包埋盒等，极大地方便了广大病理工作者的一般需要。
但是，在科研工作中，就像实验团队国家自然科学基金国际(地区)合作交流项目“急性脑梗死的责任病灶：组织学及磁共振成像评估研究”中所提及的：对于经颈动脉内膜剥脱术(carotid endarterectomy，CEA)取下来的颈动脉粥样硬化斑块，为了便于连续切片后的组织学层面能够与在体磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)的信息作精准同层比
对[5-7]，需要在组织石蜡包埋的时候将颈动脉粥样硬化斑块组织作为一个整体完整地包埋入蜡块中，然后从向心端往远心端行连续切片，最后每隔0.5- 1.0 mm取适量切片作为库存，并适当进行组织学染色，便于在相同的层面对组织学信息与MRI信息做精准对比[8-9]，也便于在3D层面全面掌握斑块组织学表现[10]。
动脉粥样硬化是全身性系统性疾病[11-12]，容易发生在大血管的分叉处。颈总动脉在颈内动脉和颈外动脉的分叉处是容易发生动脉粥样硬化的部位之一[13]。动脉粥样硬化斑块分为稳定斑块和不稳定斑块[14-15]。颈动脉粥样硬化斑块的不稳定性与脑缺血症状有直接的相关性[16-19]。高分辨率MRI能对颈动脉粥样硬化斑块成分比如纤维帽、斑块内出血、钙化等做出准确判断[5，20-22]，但亦有一定的局限性。将斑块的组织学表现和MRI信息进行同层面的精准比对将有助于推进MRI判断斑块成分的精准性[23]。
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在颈动脉粥样硬化斑块的石蜡包埋工作中，将平均长度约3 cm的颈动脉粥样硬化斑块组织完整地包埋入蜡块中是上述科研工作所必须。在石蜡包埋过程中，现有包埋盒的底模空腔容积较小，无法完整容纳整块颈动脉粥样硬化斑块组织。如果将颈动脉粥样硬化斑块组织分切成几块较小的样本再进行制片，将不能得到完整的连续切片，不利于后续组织学与MR
小制作作文I信息的同层面精准对比，也不利于在3D层面全面掌握斑块的组织学表现。在实际工作中，作者借鉴合作方美国华盛顿大学血管成像实验室的实践经验[20，22]，结合实验室的实际情况，通过一种简易包埋方法克服了颈动脉粥样硬化斑块包埋中的困难，文章将详细阐述该简易包埋方法，以方便有类似工作需求的同行参考和引用。
1 材料和方法 Materials and methods
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1.1 设计 颈动脉粥样硬化斑块整块石蜡包埋方法和包埋过程中的组织学处理。
1.2 时间及地点 于2014年1月至2018年12月在首都医科大学附属北京天坛医院临床医学研究实验室完成。
1.3 材料 颈动脉粥样硬化斑块组织取自首都医科大学附属北京天坛医院CEA手术样本，样本取材获得了伦理委员会的批准和患者的知情同意。
1.4 方法
1.4.1 包埋前的组织固定、脱钙、脱水、透明及浸蜡 颈动脉粥样硬化斑块组织比较特殊，
由于课题研究的需要，要将斑块整块包埋入蜡块中以备连续切片。其包埋前处理与常规组织的石蜡包埋前处理有所不同。作者将详细阐述实验室在斑块处理过程中的步骤和注意事项。
组织固定：将颈动脉粥样硬化斑块组织在手术剥离后30 min内置于50 mL的离心管(Corning公司，美国)中，每管只放一例，在管壁外侧标记好斑块的信息，往离心管内注入约30 mL的体积分数10%中性甲醛(益利，北京)固定液，使组织充分浸没在固定液中，液体量依组织的大小可适当调整，一般至少应确保液体与组织体积比大于10，并使组织充分浸没在液体中，由于斑块大多为管状组织且长度为3.0-4.0 cm，见图1，注入的液体量以液面能全部浸没组织为准，可在此基础上适当增加，后面所有的步骤均遵循这一标准。置于4 ℃固定3-5 d，期间换液一两次，使组织达到充分固定。
脱钙：固定3-5 d后，在离心管中，保留组织，弃掉固定液，注入适量脱钙液(ZLI-9307，中杉金桥，北京)，液体量依组织的大小适当调整，以在50 mL离心管底能够使组织充分浸没在液体中为准，置于4 ℃脱钙≥72 h，使组织达到充分脱钙。个别较大、较硬的组织，在72 h后更换脱钙液，适当延长脱钙时间。脱钙结束后流水冲洗4 h。
宽粉条怎么做好吃梯度乙醇脱水：脱钙并充分冲洗后，将组织置入离心管中，注入体积分数75%乙醇，使组织充分浸没在液体中，室温浸泡大于12 h，依次更换体积分数85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ。为了达到 较好的脱水效果，液体体积和浸泡时间一定要充分。与组织的常规石蜡包埋不同，本组织每一个乙醇梯度都需要浸泡大于12 h，遇周末可在液体中等待至下一个工作日。疯狂的蚂蚁
图1 经颈动脉内膜剥脱术(CEA)取材后的颈动脉粥样硬化斑块示例 Figure1 Carotid atherosclerotic plaque removed from the carotid endanerectomy 图注：经CEA 手术剥离出颈动脉粥样硬化斑块后，将其在30 min 内转移到实验室，用普通数码相机对斑块进行大体形态的拍照。拍照时将斑块置于边长1 cm 的正方形方格上，通过对方格的计数，可以辅助估测斑块的长度。斑块长度约3 cm (02，03，06)，少数达到或超过4 cm(04，05)。在石蜡包埋过程中，将斑块组织整块包埋入蜡块中，有效避免了斑块内成分的流失，有助于在组织学层面原位分析斑块成分。M：Male,男性；F：Female,女性；Y：年龄。
透明和浸蜡：充分脱水后，在离心管内，弃掉无水乙醇，注入适量二甲苯(益利，北京)，第1遍二甲苯浸泡过夜效果更好，过夜后，于次日早上更换第2遍二甲苯，浸泡2.0-3.0 h，
个别组织在第一遍二甲苯中2.0-3.0 h即可达到较好的透明效果。透明结束后，将组织转移到预热好的液体石蜡(Leica，德国)中，使组织在60 ℃的液体石蜡中浸蜡2.0-3.0 h。在浸蜡前对组织进行充分的脱水和充分的透明将有助于组织的充分浸蜡。浸蜡结束后，即可依照后续步骤进行整块组织的石蜡包埋。
1.4.2 手工制作合适的包埋底模 在石蜡包埋过程中，为了便于将颈动脉粥样硬化斑块整块包埋入蜡块中，需要依据下述步骤制作容积合适的包埋底模。①取普通A4纸，绘制并剪裁成如图2A所示的线格。线格由横向侧翼和纵向侧翼交叉组成，交叉处形成模具的底。横向侧翼和纵向侧翼各自长度大于4 cm(虚线间隔1 cm)。在横向侧翼上缘和下缘分别延伸1 cm，以便于在模具折叠时形成封闭的底模空腔；②线格绘制好后，将横向侧翼上缘和下缘在延伸处折叠，使形成折痕；并将底的4个边折叠，使形成折痕，如图2B，更加具体的绘制和折叠方式请参见实验团队已获得授权的实用新型专利(专利号：ZL201420609402.7)，该专利是阐述的一种石蜡包埋底模，专门用于这种较大组织的石蜡包埋，在专利申请稿中对于该底模的折叠方法有较为详细的描述；③将模具的底面坐落在水平台面上，沿底面的4个折线处使各侧翼垂直立起，即形成封闭的底模空腔，见图2C，在封闭空腔形成时，将2个横向侧翼延伸处的4个对折后的边缘分别包住相邻的侧壁；④模具折叠形成后，为加强底
模空腔侧壁的密闭性和支撑性，用宽透明胶带将各缝隙处紧密粘贴并封住，如图2D，即形成包埋所用的底模， 使用该底模，配合市售的通用包埋盒可完成后续包埋过程。
图2 用于颈动脉粥样硬化斑块的石蜡包埋底模及制作 Figure2 Embed carotid atherosclerotic plaque en blocin paraffin 图注：图A 为取A4 纸绘制并裁剪所得的线格，线格在横向侧翼上缘和下缘分别延伸出1 cm 的侧缘；B 为将延伸出侧缘和底的四个边对折形成折痕，折叠方法详见实验团队已获得授权的实用新型专利(专利号：ZL201420609402.7)；C 为沿底面的4 个折线处使各侧翼垂直立起，使形成封闭的底模空腔；D 为用宽透明胶带将各缝隙处紧密粘贴加强底模空腔侧壁的密闭性和支撑性。
1.4.3 包埋方法 在1.4.2自制包埋底模的辅助下，即可对1.4.1浸蜡后的颈动脉粥样斑块组织进行整块组织的石蜡包埋。包埋时，①依据组织的长度来调整底模的深度，如图3A，确定底模的深度后，留足容纳组织所需的空间，将多余的侧壁在折痕处剪开并向外折叠使形成侧翼，侧翼可便于移动时的捏持；②将调整好的底模置于石蜡包埋机(Leica EG1150 H，德国)的正中小冷台上(实验室石蜡包埋机在操作者一侧的正中包含一金属冷台，若不含冷台，需另配，冷台有助于底面的石蜡迅速凝固)，往底模内注入少量石蜡液如图3B，液量约
王安石的元日占底模容积的1/3；③将待包埋的颈动脉粥样硬化斑块组织站立置于底模内如图3C，注意向心端朝下；④向底模内灌注石蜡液使蜡液浸没组织如图3D；⑤覆盖市售通用包埋盒于顶端并放平如图3E，通过包埋盒的缝隙往底模内注满石蜡液如图3F；⑥待其充分凝固后，形成蜡块如图3G；⑦撕掉纸质底模，将蜡块适当修整，置于石蜡切片机(Leica RM2245，德国)蜡块座上如图3H即可进行连续切片。如此，通过从向心端向远心端进行连续切片而获得的石蜡切片在组织学层面的信息展现将具有完好的连续性，组织学层面信息的连续性便于与MRI信息进行相同层面的精准比对，也便于在3D层面全面掌握斑块的组织学表现。为后续深入研究建立了完善的切片样本库。
1.5 主要观察指标 通过文中所述的方法能够良好地将颈动脉粥样硬化斑块组织完整地包埋入蜡块中，并易于进行从向心端向远心端的连续切片。
玛丽居里的简介2 结果 Results
图3 颈动脉粥样硬化斑块整块石蜡包埋方法 Figure3 Method of embed carotid atherosclerotic plaque en blocin paraffin 图注：图A 为依据组织的长度来确定底模的深度；B为将调整好的底模置于冷台上，往底模内注入少量石蜡液；C 为将待包埋的颈动脉
粥样硬化斑块组织向心端朝下站立置于底模内；D 为向底模内灌注石蜡液使浸没组织；E 为覆盖市售通用包埋盒于顶端并放平；F 为通过包埋盒的缝隙往底模内住满石蜡液；G 为充分凝固后形成蜡块；H 为撕掉纸质底模，将蜡块修正后置于切片机的蜡块座上即可进行连续切片。
