•214.中国心血管病研究 2021 年3 月第 19 卷第 3 期Chine Journal of C ardiovascular Rearch，March 2021，Vol.I9，No.3
临床研究
非瓣膜病心房颤动患者循环miRNA-21水
平及应用价值初探
万槐斌陈冬冬边宁吴智豪列镇邦
基金项目：广东省医学科学研究基金资助项冃（A2017007)
作者单位:523059广东宵东莞市，东莞市人院南方医科大7：附厲东莞人民阪院心血管内科(万槐斌，吳智豪，列镇邦）：暨南大学附属第一医院心血管内科(陈冬冬，边宁）
通信作苦：万槐斌，E-mail:*********************
【摘要】目的探索非瓣膜病心房颤动患荇循环miRNA-21的水平及可能的应用价值.方法前瞻性
筛选2017年5月至2018年1月暨南大学附属第一医院心血管内科连续收治的非瓣膜病心房颤动患者，收集
患者的人口学特征和病史等资料根据房颤防治指南方法计算CHA:DS:-VASc评分，并分为高卒中风险组
[CHA2DS2-VASc评分>2分（男性)或>3分(女性)]和低卒中风险组[CHA2DS:-VASc评分0-1分(男性)或0-2分
(女性采集患者空腹外周静脉血,EL1SA法检测NT-proBNP;qRT-PCR法检测循环miRNA-21水平。评
估tniRNA-2丨水平与CHA:DS:-VASc评分和NT-proBNP之间的相关性，R0C曲线验证miRNA-21对高卒中风
险的预测价值结果共人选患者89例，高卒中风险患者4丨例（46.1%),CH A:DS:-VASc中位评分4(2.5〜
5.5)分.高卒中风险组与低卒中风险组血常规、肝肾功能和NT-proBNP等无显著差异；高卒中风险组循环
miRNA-21表达量较低卒中风险组显著升高[4.5_9(2.9丨-5.33)比1.71 (1.48-3.04), P< 0.001]。Pearaon相关分
析显示循环miRNA-21 表达量与 CHA:DS:-VASc评分(r=0.461 ,P=0.002>和NT-proBNP(r=0.386, P=0.013)均
显著相关R O C曲线分析提示循环miRNA-21表达量对高卒中风险具有较卨预测价值（AUC=0.843,
0.001 )_.结论循环miRNA-21吋能用于预测I W膜病心房颜动患荇卨卒中风险
【关键词】心房颤动；脑卒中；血栓栓塞；miRNA-21
doi ： 10.3969/j.issn.l672-5301.2021.03.005
中图分类号R541.4文献标识码A 文章编号1672-5301(2021)03-0214-05
A Pilot study of circulating miRNA-21 in patients with non-valvular atrial fibrillation
WAN Huai-Bin, CHEN Dong-Dong, BIAN Ning, IVU Zhi-Hao, LIE Zhen-Bcing. Department o f Cardiology,
Dongguan people's hospital. Southern Medical University, Dongguan 523059, China i WAN Huai-Bin. WU Zhi-
Hao, LIE Zhen -Bang)；Department o f Cardiology, the First Affiliated Hospital, Jinan University, Guangzhou
510630, China ( CHEN Dong-Dong, BIAN Ning)
Corresponding author: WAN Huai-Bin, Email：********************
【Fund program】The Guangdong Medical Rearch Foundation (A2017007)
【Abstract】Objective To explore the level and significance of circulating miRNA-21 in patients with non-
valvular atrial fibrillation (NVAF). Methods A study of prospectively enrolled concutive patients with NVAF
admitted to the Dept, of Cardiology, the First AtTiliated Hospital, Jinan University was conducted between May
2017 and Jan 2018. The demographic characteristics and medical histories were collected. CHA：DS：-VASc score
was calculated according to clinical guidelines and patients were divided into high risk of stroke [CHA；DS：-VASc
score ^ 2 (male) or ^ 3(female)] and low risk group [CHA；DS：-VASc score 0-1 (male) or 0-2(female)]. The fasting
peripheral venous blood was drawn for biomarkers detection. NT-proBNP was tested by the ELISA assay and
circulating miRNA-21 was determined by qRT-PCR. The predictive value of miRNA-21 was assd by ROC
curve. Results A total of 89 patients were enrolled. 41 patients (46.1%) were at high risk of stroke and the
median CHA：DS：-VASc score was 4 (2.5-5.5. There was no significant difference in blood routine test, liver and
renal function and NT-proBNP between the patients at high risk of stroke and tho at low risk of stroke. However,
中国心血管病研究2021 年3 月第 19卷第 3 期Chine Journal of C ardiovascular Rearch .March 2021 ,Vol. 19，No.3
•215* circulating miRNA-21 levels were significantly incread in patients at high risk o f stroke (P< 0.001). Pearson
analysis showed that circulating miRNA-21 levels were significantly correlated with CHA2DS：-VASc score (r=0.461,
P=0.002) and NT-proBNP (r=0.386, P=0.013). ROC analysis indicated that circulating miRNA-21 levels were of
more value to predict the risk of stroke with an AUC 0.843 (P<0.001). Conclusions Circulating miRNA-21 level
might be a valuable biomarker to predict the risk o f stroke in patients with NVAF.
【Keywords】Atrial fibrillation; Stroke; Thromboembolism; miRNA-21
心房颤动（房颤）是临床上最常见的持续性心 律失常之一。血栓栓塞是房颤患者最常见的致残 和致死性并发症，其中又以缺血性卒中最为常见["。非瓣膜病房颤患者缺血性卒中风险是普通人群的 5~7倍[11。抗凝治疗已成为具有高卒中风险的房颤 患者改善预后的最重要治疗。非瓣膜病房颤患者 的卒中风险目前主要依赖临床评估。2010年以后 的国内外房颤防治指南均推荐应用CHA:DS2-VAS c 评分
系统进行卒中风险评估M。对于CHA:DS:-VASc评分男性>2分或女性>3分的非瓣膜病房颤 患者应给予抗凝治疗m。CHA:DS:-VASc评分基于 临床，简单、易于掌握，但对卒中风险的估测精度 仍有待提高。新近有回顾性研究提出了 A BC卒中 和死亡评分，即包含年龄(A)、血浆生物标志物(B) (hs-Tn和NT-proBNP(N末端B型利钠肽原）)和临 床卒中/TIA病史(C)的评分模型，其对终点事件的 预测价值优于CHA2DS2-VASc评估方案[4)，提示血 浆生物标志物在房颤卒中风险预测中具有重要价值。
非编码miRNA是当前疾病相关生物标志物探 索的热点之一。研究表明，miRNA-21可诱导心肌 肥厚，促进心肌纤维化和心衰的发生[561。外周循环 miRNA-21的升高与高血压[7'81、糖尿病[9]、心功能不 全15]、卒中™、冠心病[||12]等疾病的发生均存在相关 性。这些均是房颤患者卒中发生的高危因素。因此，我们假设房颤患者外周循环miRNA-21水平与 卒中风险之间存在相关性。为验证该假设，本研究 以非瓣膜病房颤患者为研究对象，以探索循环 miRNA-21表达量与CHAJDSrVASc评分等指标之 间的关系。
1资料和方法
1.1研究对象本研究前瞻性收集2017年5月至2018年1月在暨南大学附属第一医院心血管内科 住院的连续心房颤动患者临床资料。本研究经暨 南大学附属第一医院医学伦理委员会批准后执行 (编号:2016-031)。入选标准:①35岁以上，男女不 限;②本次或者既往心电图检查明确诊断为心房颤动，临床类型
不限;③签署知情同意书。排除标准：①瓣膜病心房颤动，即风湿性二尖瓣狭窄或者曾经 行瓣膜修复或瓣膜置换手术;②合并急性感染性疾 病（近2周有发热史，或者入院血常规提示白细胞 计数>11 x 107L);③3月内患急性冠脉综合征或急 性卒中；④各种原因引起的休克或低血压状态；⑤ 合并显著的肾功能不全（按M D R D公式估测肾小 球滤过率（eGFR)$50 m l•m in_1' 1.73m:))或肝功能 不全指（谷氨酰氨 >基转移酶(ALT)>E常上限1.5倍）;⑥合并血液系统疾病，如血栓性疾病、血友病、白细胞或血小板减少等;⑦妊娠状态或服用避孕药 物；⑧合并恶性肿瘤、风湿性疾病和精神疾病等。由两位副高级以上职称的医师独立按以上标准审 核诊断的正确性，有争议的结果由本研究小组成员 共同讨论决定。
1.2 —般资料的收集和分组收集患者的基线临床数据，包括性别、年龄、吸烟和饮酒史等；根据患 者临床病史和本次住院期间检查结果，结合目前心 血管疾病诊疗指南确定慢性心功能不全、高血压、糖尿病、中风和短暂性脑缺血发作、冠心病或周围 血管疾病等诊断。测量首诊时坐位休息5分钟后 血压，记录体重(kg)和身高(m)。根据房颤防治指 南方法计算CHA2DS2-VASc评分[K2]，将患者分为高 卒中风险组[CHA:DS2-VASC评分>2分（男性）或>3 分（女性)]和低卒中风险组[CH A:DS:-VASC评分0- 1分(男性)或0-2分(女性)]。
1.3血样采集及临床化验采集患者空腹8h以上 外周静脉血，采用肝素抗凝管和3.2%枸橼酸钠抗凝 管分别采集外周静脉血样。4°C ，离心率4000 r/min，离心10 min后取上清液。血常规、肝肾功、NT-proB
NP等项目在采样后 12h内检测。NT-proBNP 采用商业化试剂盒ELI S A法检测(Duot)。用于 miRNA检测的血样保持至-80°C冰箱集中检测。
1.4外周血循环miRNA-21表达量检测血浆循 环总RNA提取采用商业化的TRIZOL试剂（Invit-rogen，美国），按照说明书方法执行。抽提完成的总 RNA，在分光光度计的吸收值A260nm/A280nm 为
•216*
中国心血管病研究202丨年3 月第丨9 卷第 3 期CI“，ieJ()urmilofCaniiovascitkirRean'h，Matvh2()2I，Vol.l9，No.3
1.8〜
2.1 (浓度约500ng/nl)时用于cDNA合成。按照 如下方案构建15卜il的逆转录反应体系：由100mol/L dNTP(dTTP) 0.15^1，m ultiScribe 逆转录酶 50U/nl 丨…，l〇x逆转录缓冲液1.5(_d，RNa抑制剂20 U/nl 0.]9…和无核酸水4.16卩1构建成7卜il的主混合物，再加入3|il 5x逆转录引物和5…总RNA样本，离心 混匀。人miRNA-21逆转录引物5 ’-GTCGTATC-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3 ’，内参 U6 弓丨物逆转录弓I物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-31。逆 转录环境：16°C x30min，42°C x30min，85°C x5min，然后置于4°C。构建实时定量PCR反应体系：通用 PCR主混合物I I10吣无核酸
水7.67|i l，小RNA试 剂盒（20>〇小丨，加上述逆转录产物1.33^1，共构成 20ul反应体系，离心混匀。人miRNA-21前向引物，-GTGCAGGGTCCGAGGW ，逆向弓| 物，5、GCCGCTAGCTTATCAGA CTGATGT-3'。内参 U6 分子前向引物 5f-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，逆 向引物 5、AACGCTTCACGAATTTGCGT-3、实 时定量 PCR环境：50°C x2min,95-C x lOmin，然后 进入PCR循环，95°015s变性，60°C x60s退火延 K，共40个循环。采用2i T法1131评估循环rmRNA-21的表达量。每个标本采用3复孔，取平均值记录。
1.S统计学分析正态分布的连续变量数据采用 ^±5记录，两组间比较采用？检验。I卜：正态分布的连 续变米用M(IQR)表不，米用t/检 验。计数数据以例数及百分率表示，计量资料相关 分析采用作狀仍/?法。采用ROC曲线验证miRNA-21等变量对高卒中风险的预测价值。采用spss 2
2.0软件（IBM，美国）执行数据统计和分析，P< 0.05表示差异具有统计学意义。2结果
2.1研究对象的一般特征本研究共前瞻性的筛选连续往院的房颤患者176例，根据入选和排除标 准，最终入选非瓣膜病房颤患者89例，其中男性49 例（55.1%)，平均年龄（60.51 土 14.56)岁，中位 C H A d V A S c评分2(]-
3.5)分，使用抗凝药物治 疗患者33例（37.1%)。高卒中风险患者41例(46.1%)，中位 CHA:DS:-VASc评分 4(2.5-5.5)分。两组患者基线特征比较见表1。
2.2不同卒中风险患者实验室检测结果低卒中 风险组和高卒中风险组患者之间血常规结果比较 差异无统计学意义，见表2。高卒中风险组肝肾功 能结果和NT-proBNP结果存在恶化趋势，但与低卒 中K险组比较差异无统计学意义。循环miRNA-21表达量两组之间比较，差异有统计学意义。
2J循环 miRNA-21 表达量与 CHA2DS2-VASc评分等的关系Pearso/；相关分析发现，循环miRN A-21表达量与CHA:DS:-VASc评分之间显著相关性 (r=0.46l ,/M).002)。此外，循环 miRNA-21 表达量 还与 NT-proBNP存在显著相关(r=0.386, P=0.013)。NT-proBNP与CHA:DS:-VASc评分之间未见显著相 关性（r=-0.175,P=0.275)。RO C曲线分析，循环 miRNA-2丨表达量对应曲线下面积为0.843 (P< 0.001), NT-proBNP对应的曲线下面积为0.612 (
0.069)，提示miRNA-21表达量对房颤患者高卒中 风险的预测价值可能高于NT-proBNP。
微信昵称大全3讨论
成都都江堰一日游攻略本研究发现，非瓣膜病房颤患者循环miRNA-21 表达量 与CHA:DS:-VASc评分和 NT-proBNP水 平显著正相关。由于CHA:DS:-VASc评分与NT-proBNP均 ~非瓣膜病 房颤患 者卒中 事件的 发生等
表1不同卒中风险患者的基线特征比较[.t o.例数及百分率(％)]
组別例数男性
n(%)
年龄
(岁）
BMI
(kg/m-)
收缩压
(mmHg)
吸烟
n(%)
饮酒
n(%)
低卒中风险组4826(54.2)52.9±12.825.01 ±3.04114.2 士14.812(25)9(18.8)高卒中风险组4123(56.1 )69.4±11.122.40±3.95133.0±22.79(22)4(9.8) Z3值-0.855<0.0010.003<0.0010.7360.231
组別慢性心雌不全
n(%)
高血压
n(%)
糖尿病
n(%)
脑卒中或TIA
病史
n(c/r)
冠心病或外周血
管疾病
n(%)
CHADS-VASc
评分
假如时间可以倒流抗凝药物治疗
n(%)
低卒中风险组13(27.1 )13(27.1)3(6.3)04(8.3)1(1-2)12(25.0)高卒中风险组19(46.3)29(70.7)23(56.1)8( 19.5)14(34.1)4(2.5-5.5)21(37.1) /"值0.059<0.001<0.0010.0010.003<0.0010.011风险组:CHA2DS3-VASc评分男性>2分.女性>3分c BMI：体TIAt短暂fflSf 缺血发作
中国心血管病研究2021 年3 月第 19 卷第 3 期Chine Jounial of C ardiovascular Rearch.March 2021 ,Vol. 19，No.3
•217-表2不同卒中风险患者实验室检测指标比较[b，M(P25，/V5)]
组别WBC( 107L)Hb(g/L)Plt( 107L)ALT.U/L
eGFR
(ml-m in'1.73ni:)
NT-proBNP
(pg/mL)
miRNA-21
表达量
低卒中风险组7.14±1.72142.0 士14.6199.4 士55.920(15,27)82.3 士18.4
544.3
(297.7,2307.0)
1.71(1.48.3.04)
高卒中风险组 6.94 土1.60135.8 土20.4207.2士64.522.5(17.6,34.8)75.5 士18.5
1938.1
(392.5,6064.3)
4.59(2.91,
5.33)
p W.0.5710.1020.5430.0510.0900.069<0.001注：高卒中风险组:CHA2DSrVASc评分男性> 2分，女性》3分。W B C：白细胞计数;H b：血红蛋白;P it：血小板计数；礙獨
的肾'j、球滤过率;NT-proBN P: N末端B型利钠狀原
不良预后相关[141，因此循环miRN A-21可能预测非 瓣膜病房颤患者高卒中风险。
CHA:DS2-VASc评分是经典的用于评估房颤患 者卒中风险的工具，高CHA:DS:-VASc评分与左心 房的血栓形成及缺血性卒中的发生密切相关[2〜5]，因此指南推荐用该评分指导房颤患者的抗凝治疗 方案的选择m。本研究发现循环miRNA-21表达量 与CHA:DS:-VASc评分具有显著的相关性，当我们 按CH
A:DS:-VASc评分对纳入的房颤患者进行卒 中风险分类后，高水平的miRNA-21对高卒中风险 具有较高的预测价值。
由于生物标志物可能提供疾病的病理生理状 态和疾病严重性方面的信息，因此可能更好的预测 临床预后。本研究与新近Shen等[161的生物信息学 研究结果一致，均发现房颤患者循环miRN A-21表 达量增加。此外，本研究发现miRNA-21与NT-proBNP也存在显著的相关性，该结果与Zhang等1171近期报道也基本吻合。miRNA-21可通过抑制PTEN表达参与修复和抗炎效应[18]。在髙血压[7'81和糖尿病m等慢性病患者，以及动脉粥样硬化性心脑 血管疾病患者的急性期，均存在循环miRNA-21水 平升高，且与炎症因子的表达呈负相关[H U9]。具备 一个或者多个上述特征的高卒中风险的患者，具有 更高的炎症因子水平。此外，miRNA-21等非编码 RNA还参与房颤患者心房的机械重构和电重构过 程[5'\但循环nnRNA-21是否同样可预测房颤患者 缺血性卒中和死亡风险，有待进一步研究证实。
综上，循环miRNA-21表达量可能预测非瓣膜 病房颤患者卒中风险。值得注意的是，不论是 CHAJDS:-VASc评分还是广泛应用于临床的NT-proBNP检测值都只是评估卒中事件和全因死亡等 风险的中间指标[141。本研究由于样本量的限制，尚无法直接评估循环miRNA-21水平对房颤患者卒中等事件发生的实际预测价值。因此需要设计较 大样本的前瞻性队列研究来验证循环miRNA-21 水平对非瓣膜病房颤动患者缺血性卒中等终点事 件的应用价值。此外，miRNA-21检测尚没有标准 化，不同研究者报道的结果差异较大，因此对本研 究结果的推广和解读仍需谨慎。
女照片
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献万槐斌：研究设计、实施、论文的拟定和撰写：陈冬冬、边宁：病例筛选和资料收集；吴智豪、列镇邦：资料整理、数据分析和论文起草
4参考文献
f 1 ] Hindricks G, Potpara T, Dagres N, et al. 2020 ESC Guidelines for
the diagnosis and management of atrial fibrillation developed in collaboration with the European Association of Cardio-Thoracic Surgery (EACTS). Eur Heart J. 2020: ehaa612. DOl: 10.1093/eur- heartj/ehaa612.
[2] Sterne JA, Bodalia PN, Bryden PA, et al. Oral anticoagulants for
primary prevention, treatment and condary prevention of venous thromboembolic dia, and for prevention of stroke in atrial fibrillation: systematic review, network meta-analysis and cost-effectiveness analysis [J]. Health Technol Asss 2017, 21(9): 1- 386. DOI: 10.3310/hta21090.
ao韵[3]张琦，刘丽云，原向芝，等.非瓣膜病心房颤动患者卒中风险评
估方法的探讨[J].中国心血管病研究，2019,17(11): 1003- 1008. DOI: 10.3969/j.issn.l672-5301.2019.11.010.
[4] Hijazi Z, Oldgren J, Lindback J, et al. A biomarker-bad risk
score to predict death in patients with atrial fibrillation: the ABC (age, biomarkers，clinical history) death risk score [J」•Eur H J, 2018,39(6):477-485. DOI: 10.1093/eurheartj/ehx584.
[5] Dong S, Ma W, Hao B, et al. microRNA-21 promotes cardiac fi
brosis and development of heart failure with prerved left ventricular ejection fraction by up-regulating Bcl-2 [J I. Int J Clin Exp Pathol,2014,7(2):565-574. DOI: 10.1158/1055-9965.EPI-13-1186.
•218.
中国心血管病研究 202 丨汁.3 月第 19 卷第 3 期Chine Journal o f C ardiovascular Rearch，March 2021，V ol. 19，No. 3
[6j Tao H, Zhang M, Yang J J, et al. MicroRNA-21 via dysregulation of WW domain-containing protein 1regulate atrial fibrosis in atrial fibrillation [J]. Heart Lung Circ, 2018, 27(1): 104-113. DOI:
10.1016/j.hlc.2016.01.022.
[7] Cengiz M. Yavuzer S, Kili^kiran Avci B, et al. Circulating miR-21
and eNOS in subclinical atherosclerosis in patients with hypertension [j]. Clin Exp Hypertens,2015,37(8):643-649. DOI: 10.3109/ 10641963.2015.1036064.
[8] Xiao L, Yongxiang W, Zuoguang W. microRNA-2I and hyperten
sion [j], Hypertens Res, 2018, 41(9): 649-661. DOI: 10.1038 / S41440-018-0071-z.
[9] Sekar D, Venugopal B, Sekar P, et al. Role of microRNA 21 in dia
betes and associated/related dias [ J Gene, 2016,582(1): 14-
18. DOI: 10.2016.01.039.
I10] Lin S P, Ye S, Chen X H, et al. Incread expression of microRNA-21 in peripheral blood mediates the down-regulation of IFN - y and increas the prevalence of stroke-associated infection! J]. J Neurol Sci,2016,366:235-239. DOI: 10.1016/j.
jns.2016.03.034.
幼儿园识字表
[11 ]阮忐敏，武力勇，朱国富，等.mic丨x)RNA2丨与冠心病的相关性
研究[J].临床心血管病杂翁，2015,31(l):50-53. DOI: 10.13201/ j.issn.1001-1439.2015.01.013.
I 12 ] Darabi F, Aghaei M, Movahedian A, et al. The role of rum
levels of microRNA-21and matrix metalloproteina-9 in patients with acute coronary syndrome [ J .Mol Cell Biochem, 2016,422(l-2):51-60. DOI: 10.1007/sl 1010-016-2805-z.
[13 j Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression哪种睫毛膏最好
data using real-time quantitative PCR and the 2 A A C T Method [J].
Methods,2001,25(4):402-408. DOI: 10.1006/meth.2001.
[14 ]Kristenn SL, Mogenn UM, Jhund PS, et al. N-terminal Pro-
B-Type natriuretic peptide levels for risk prediction in patients with heart failure and prerved ejection fraction according to atrial fibrillation status [J]. Circ Heart Fail 2019,12(3): e5766.
DOI: 10.1161/CIRCHEARTFAILURE. 118.005766.
[15]韩隹，王云飞，王儀旺，等.CHADS2评分与CHA2DS2-VASC
评分在非瓣膜病房颤患者左房血栓风险评估中的对比分析
[』].中国老年学，2016,036(11):2670-2672.001:10.3969/>|.
issn. 1005-9202.2016.11.046.
116 J Shcn N N, Zhang C, Li Z, et al. MicroRNA expression signatures of atrial fibrillation: The critical systematic review and bioinformatics analysis [J]. Exp Biol Med (Maywood),2020,245 (l):42-53. DOI: 10.1177/1535370219890303.
17] Zhang J, Xing Q, Zhou X，et al. Circulating miRNA-21 is a promising biomarker for heart failure [J j. Mol Med Rep. 2017, 16(5):7766-7774. DOI: 10.3892/mmr.2017.7575.
拉开序幕(18 | Zhou S, Sun Y, Zhao K, et al. miR-21/PTEN pathway mediates
the cardioprotection of geniposide against oxidized low-density lipoprotein-induced endothelial injury via suppressing oxidative stress and inflammatory respon [J]. Int J Mol Med. 2020, 45
(5):1305-1316. DOI: 10.3892/ijmm.2020.4520.
[19 ]Darabi F, Aghaei M, Movahedian A, et al. Association of rum
microRNA-21 levels with Visfatin, inflammation, and acute coronary syndromes [Jj. Heart Vesls, 2017, 32(5): 549-557.
DOI: 10.1007/s00380-016-0913-z.
(收稿日期= 2020-03-25)
