甘蔗蜡提取物多廿烷醇的降血脂机制研究
廖芳;陈伟伟
【摘 要】采用RT-PCR、Western Blot、L-[35S]放射性标记物掺入等方法,观察甘蔗蜡提取物多廿烷醇对Hep G2细胞羟甲基戊二酸辅酶A (HMG-CoA)还原酶mRNA转录及蛋白质表达量的影响,及其对HMG-CoA 还原酶合成和降解的作用.结果表明,多廿烷醇降低HMG-CoA还原酶mRNA的转录和蛋白质的表达量,且作用效果随多廿烷醇浓度的升高而增强.此外,多廿烷醇抑制HMG-CoA还原酶的合成并加速其降解,多廿烷醇处理后HMG-CoA还原酶的半衰期明显缩短.%The effects of policosanol extracted from sugarcane wax on mRNA transcription and protein expression level,synthesis and degeneration of 3-hydroxy-3-methylglutarl-coenzyme (HMG-CoA) reducta in Hep G2 cell were determined by RT-PCR,Western Blot and L-[35S] radioactive isotope tracing technology.The results showed that the mRNA transcription and protein expression level of HMG-CoA reducta decread with the increa of policosanol concentration(10,20,30 μg/L).Policosanol also suppresd the synthesis of HMG-CoA reductas while sped up its degeneration; the half life of HMG-CoA reductas treated by policosanol was shortened obviously.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】江畔独步寻花全诗2013(052)005
【总页数】4页(P1125-1128)
【关键词】多廿烷醇;Hep G2细胞;羟甲基戊二酸辅酶A(HMG-CoA)还原酶
【作 者】廖芳;陈伟伟
【作者单位】赣南医学院药理学教研室,江西赣州341000;赣南医学院药理学教研室,江西赣州341000
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.5
正常细胞通过羟甲基戊二酸辅酶A（3－hydroxy－3－methylutaryl－coenzyme A，HMG－CoA）还原酶调节内源性胆固醇合成，通过低密度脂蛋白受体（Low densitylipoprotein rec
eptor，LDL－R） 介导的 LDL 内吞提供外源性胆固醇，外源性和内源性胆固醇又通过特定机制相互调节，以保持细胞胆固醇水平的相对稳定。多廿烷醇（Policosanol）是一种从甘蔗蜡中提取的含有8种主要脂肪醇的混合物［1］，每种脂肪醇的比例相当稳定，其中相对分子量为410.5的二十八烷醇含量最高［2］。有研究表明多廿烷醇对HMG－CoA的活性没有直接抑制作用，它对胆固醇生物合成的抑制作用是在乙酸盐消耗和甲羟戊酸的合成步骤中，提示多廿烷醇的作用点可能在HMG－CoA 还原酶的合成或降解上［3－5］。 本研究以肝癌细胞株Hep G2细胞为研究对象，考察多廿烷醇对Hep G2细胞HMG－CoA还原酶mRNA转录和蛋白质表达量，以及HMG－CoA还原酶合成和降解的影响，以揭示其降低血脂的分子机制。
1 材料和方法
1.1 仪器与试剂
主要仪器有INCO2108型CO2细胞培养箱（德国），PAC3000 电泳仪 （美国），PTC－100TM 型 PCR扩增仪（美国），同位素扫描仪（Forma，美国）。主要试剂包括 L－［35S］蛋氨酸（Upstate，美国）、兔抗人HMG－CoA 还原酶抗体（Upstate，美国）、
β－actin 兔IgG单克隆抗体 （上海康成生物工程有限公司）、羊抗兔 IgG（KPL，美国），HMG－CoA 还原酶引物及内参照β－actin引物均由上海鼎安生物科技有限公司合成。多廿烷醇 （古巴Laboratorios Dalmer S.A生产），先用少量的无水乙醇溶解，并在75℃水浴中加热 10 min，加 F68（Poloxmer 108）配成 10 g／L 的贮存液备用。
1.2 方法
1.2.1 细胞株的培养 Hep G2细胞在含10%（质量分数，下同）RPMI 1640的培养液中37℃、5%CO2及饱和湿度条件下常规传代培养。培养液中分别添加 10、20、30 μg／L 多廿烷醇作为处理组，同时设置空白对照和溶剂对照（F68 2.0 g／L）。
1.2.2RT－PCR 分析 HMG－CoA 还原酶 mRNA 的转录水平 各处理细胞培养24 h后采用Trizol法提取 RNA，取提取的总 RNA 4 μg，用 M－MuLV 逆转录酶制备cDNA。取0.2 mL PCR管，依次加入去离子水 14.4 μL、PCR Buffer 2 μL、dNTPs 0.4 μL、引物 1.0 μL、cDNA 0.1 μg、Taq 酶 0.2 μL，混匀，进行 PCR 扩增。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，35个循环；再在72℃延伸10 min。取扩增产物10 μL进行琼脂糖凝胶电泳并拍照。用Bandscan 5.0图像分析软件进行光密度
分析。抑制率＝（溶剂对照组光密度－多廿烷醇处理组光密度）／溶剂对照组光密度×100%。
1.2.3 Western blot分析 HMG－CoA 还原酶蛋白质的表达量 各处理细胞培养24 h后提取细胞总蛋白，用微量加样器分别取蛋白分子量标准5 μL和各处理的总蛋白提取缓冲液20 μL加于孔底进行电泳，制备“三明治”夹心，将蛋白质转移到PVDF膜上，用 Blocking Buffer封闭 PVDF 膜，60 r／min、37 ℃振荡1 h或4℃过夜，加入兔抗人HMG－CoA还原酶抗体 5 μL，60 r／min、37℃振荡 1 h 或 4℃过夜。 加入羊抗兔 IgG 1 μL，60 r／min、37 ℃振荡 1 h 或 4 ℃过夜。ECL试剂盒显影，用Bandscan 5.0图像分析软件进行光密度分析，用各目的蛋白与内参β－actin蛋白的光密度之比表示目的蛋白的相对含量。每个图像均重复分析3次，取平均值。
1.2.4 多廿烷醇对HMG－CoA还原酶合成的影响各处理细胞培养液更换为无蛋氨酸培养液（含10%LPDS）培养15 min，加入不同浓度的多廿烷醇培养90 min，加入 L－［35S］蛋氨酸分别培养 0、10、20 min，应用同位素示踪、免疫沉淀法和SDS－PAGE电泳检测Hep G2细胞HMG－CoA还原酶蛋白质，图像分析系统测定Hep G2细胞HMG－CoA还原酶蛋白光密度，判断不同浓度多廿烷醇对Hep G2细胞HMGCoA还原酶合成的影响。
蚌1.2.5 多廿烷醇对HMG－CoA还原酶降解的影响各处理细胞培养液更换为无蛋氨酸培养液（含10%LPDS）培养15 min，加入L－［35S］蛋氨酸培养 60 min，然后加入不同浓度的多廿烷醇分别培养0、30、60、120、180 min。应用同位素示踪、免疫沉淀法和SDS－PAGE电泳检测 Hep G2细胞 HMG－CoA还原酶蛋白质，图像分析系统测定Hep G2细胞HMGCoA还原酶蛋白光密度，分析不同浓度多廿烷醇对Hep G2细胞HMG－CoA还原酶降解率的影响，并计算出 HMG－CoA 还原酶降解半衰期（T1／2）。
1.2.6 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件包进行统计分析，数据以样本均数±标准差表示。计量资料主要统计指标均进行正态性及方差齐性检验；组内、组间比较用t检验或方差分析；非正态分布样本用秩和检验或Mann－Whitney U检验；计数资料采用 χ2检验。
2 结果与分析
2.1 多廿烷醇对HMG－CoA还原酶mRNA水平的影响
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从RT－PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果（图1）观察到，随着多廿烷醇浓度的升高HMG－CoA还原酶PCR产物条带逐渐变细；图像分析结果（表1）显示添加多廿烷醇的处
理组中mRNA相对含量均极显著低于溶剂对照（P＜0.01），且随着多廿烷醇的浓度升高，HMG－CoA还原酶mRNA光密度逐渐降低，呈明显的剂量依赖关系。
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图1 PCR检测多廿烷醇对Hep G2细胞中HMG－CoA还原酶mRNA水平的影响M.DNA Marker； A.空白对照；B.溶剂对照；C.10 μg／L 多廿烷醇；D.20 μg／L 多廿烷醇；E.30 μg／L 多廿烷醇
表1 多廿烷醇对Hep G2细胞HMG-CoA还原酶mRNA水平的影响注：**表示该处理与溶剂对照组相比差异极显著（P<0.01）。下同。14.16 27.86 47.61处理空白对照溶剂对照10 μg/L 多廿烷醇20 μg/L 多廿烷醇30 μg/L 多廿烷醇mRNA相对含量2.738±0.130 2.825±0.120 2.425±0.110**2.038±0.080**1.480±0.060**抑制率//%
2.2 多廿烷醇对HMG－CoA还原酶蛋白质含量的影响
简单的鱼从Western blot结果（图2）可观察到，随着多廿烷醇浓度升高，细胞中HMG－CoA还原酶蛋白质条带逐渐变细；图像分析结果（表2）显示添加多廿烷醇的处理组中目的蛋白的相对含量均极显著低于溶剂对照（P＜0.01），随着多廿烷醇的浓度逐渐升高，HMG－CoA还原酶蛋白质光密度逐渐降低，呈明显的剂量依赖关系。蓝牙手表
图2 Western blot检测多廿烷醇对Hep G2细胞中HMG－CoA还原酶蛋白质含量的影响A.空白对照；B.溶剂对照；C.10 μg／L 多廿烷醇；D.20 μg／L 多廿烷醇； E.30 μg／L 多廿烷醇
2.3 多廿烷醇对HMG－CoA还原酶合成的影响房屋安全鉴定
多廿烷醇对HMG－CoA还原酶合成的影响结果见表3。由表3可知，随着处理时间的延长，溶剂对照组HMG－CoA还原酶蛋白质光密度明显升高，多廿烷醇处理组HMG－CoA还原酶蛋白质光密度仅略微升高，与同时间的溶剂对照比较差异达极显著水平（P＜0.01）。且在试验范围内处理时间越长，其对HMG－CoA还原酶合成的抑制率越大，呈明显的时间依赖关系。
