tissue engineering[J].Tissue Eng Part C Methods,2009,15(2):115-124.doi:10.2008.0288.
[16]Guyatt GH,Townnd M,Berman LB,et al.A comparison of Likert and visual analogue scales for measuring change in function[J].J Chronic Dis,1987,40(12):1129-1133.doi:10.1016/0021-9681 (87)90080-4.
[17]Sung YT,Wu JS.The visual analogue scale for rating,ranking and paired-comparison(VAS-RRP):A new technique for
psychological measurement[J].Behav Res Methods,2018,50(4):1694-1715.doi:10.3758/s13428-018-1041-8.
[18]Wada E,Fukui M,Takahashi K,et al.Japane orthopaedic association cervical myelopathy evaluation questionnaire (JOACMEQ):Part5.Determination of responsiveness[J].J Orthop Sci,2019,24(1):57-61.doi:10.1016/j.jos.2018.08.015.
(2021-09-13收稿2021-09-27修回)
(本文编辑陆荣展)
一种基于体内CTC捕获的CellCollector®技术对乳腺癌
患者分层的价值
王玲艳1,2,高春晖2,冯雪园2,崔鑫淼2,孙建云2,何向辉1△
摘要:目的探讨基于CellCollector®技术捕获的循环肿瘤细胞(CTC)用于筛选转移风险较高的乳腺癌患者的可
能性。方法入组60例原发性乳腺癌患者为乳腺癌组,其中Ⅰ期16例、Ⅱ期29例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4例。通过CellCollector®进行至少1次外周血CTC检测,并随访4~19个月。同时入组10例健康女性志愿者作为对照组,仅进行1次CTC检测。分析不同年龄、绝经情况、TNM分期、分子分型、Ki-67表达程度患者CTC阳性率的差异。结果
乳腺癌组基线CTC检出率为73.33%;Ⅰ~Ⅳ期检出率分别为43.75%、82.76%、81.82%和100%,不同临床分期下CTC
检出率差异有统计学意义。不同年龄、是否绝经、不同分子分型及Ki-67表达程度患者CTC检出率差异均无统计学
意义。24例行2次CTC检测。4例疾病进展患者中,1例CTC数目增多;20例无疾病进展患者中,3例CTC数目增加。CTC数目动态变化与疾病进展不存在相关性。结论CellCollector®体内CTC检测技术在非转移性乳腺癌中检出率较高,为CTC筛选转移风险较高的乳腺癌患者提供了可能。
关键词:乳腺肿瘤;肿瘤细胞,循环;CellCollector®;体内检测;动态监测
中图分类号:R737.9文献标志码:A DOI:10.11958/20210761
The value of CellCollector®in vivo CTC capture technology for stratification of
breast cancer patients
WANG Ling-yan1,2,GAO Chun-hui2,FENG Xue-yuan2,CUI Xin-miao2,SUN Jian-yun2,HE Xiang-hui1△1Department of General Surgery,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin300052,China;2Department of
Breast Surgery,Baoding First Central Hospital
△Corresponding Author E-mail:**************
Abstract:Objective To explore the possibility of using circulating cancer cells(CTC)captured by CellCollector®technology for screening breast cancer patients with higher risk of metastasis.Methods Sixty patients with primary breast cancer were enrolled as the breast cancer group,including16in stageⅠ,29in stageⅡ,11in stageⅢand4in stageⅣ. Patients were tested for at least one CTC detection through CellCollector®and followed up for4-19months.At the same time,10healthy female volunteers were enrolled as the control group,and only one CTC test was performed.The CTC positive rates in patients with different age,menopau,TNM stage,molecular typing and Ki-67expression were analyzed. Results The baline CTC detection rate of breast cancer patients was73.33%.The detection rates ofⅠ-Ⅳstage were 43.75%,82.76%,81.82%and100%,respectively.There were significant differences in the detection rates of CTC under different clinical stages(P<0.05).There were no significant differences in CTC detection rates in patients with different
作者单位:1天津医科大学总医院普外科(邮编300052);2保定市第一中心医院乳腺外科
作者简介:王玲艳(1981),女,本科,主治医师,主要从乳腺恶性肿瘤的早期诊断及综合治疗。E-mail:*****************
△通信作者E-mail:**************
应用研究
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤。2015年我国女性乳腺癌新发病例约30.4万例,占女性全部恶性肿瘤发病的17.1%;死亡病例约7.0万例,占女性全部恶性肿瘤死亡的8.2%[1]。20%~30%的原发性乳腺癌患者因局部复发或远处转移而危及生命[2-3]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)指自发或因诊疗操作由原发灶或转移灶脱落进入外周血循环的肿瘤细胞。CTC与癌症远处转移有直接关系,是液体活检重要标志物之一[4-5],可用于指导治疗、监测疗效、风险分层以及预测预后[6-8]。传统的CTC检测技术由于标本量较少(通常为3~10mL外周血),以致CTC检出率较低,一般低于50%[9]。因此,克服外周血标本体积限制对提高CTC捕获率和检出率有重要意义[10]。CellCollector®是全球首创的体内CTC 检测技术,已被用于包括乳腺癌在内的多个癌种的临床诊断。CellCollector®体内CTC检测技术通过留置针肘静脉留置30min,期间过血量约1500mL,从而大大提高了CTC检测的敏感度。既往报道在乳腺癌、肺癌等多个癌种中CellCollector®检出率可达71%[11]。目前,基于CellCollector®技术捕获CTC在非转移性乳腺癌中的研究较少。本研究使用
CellCollector®技术,分析不同临床特征乳腺癌患者CTC检出率的差异,以及CTC动态变化与患者疾病进展的关系,探讨其用于筛选转移风险较高的乳腺癌患者的可能性。
1对象与方法
1.1研究对象选取2018年9月—2020年12月就诊于天津医科大学总医院经病理检查确诊为原发性乳腺癌的女性患者。纳入标准:(1)肿瘤均位于单侧。(2)不伴有其他脏器恶性肿瘤及其病史者。排除标准:(1)合并心肾等重要脏器功能不全者。(2)妊娠及哺乳期女性。共纳入60例乳腺癌患者为乳腺癌组,年龄30~78岁,平均年龄(50.15±1
2.05)岁,绝经者32例。其中Ⅰ期16例、Ⅱ期29例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4例。根据基线CTC检出情况将患者分为CTC阳性组和CTC阴性组。另外,纳入同期10例健康女性志愿者为对照组,年龄28~72岁,平均年龄(49.60±15.39)岁,绝经者5例。乳腺癌组和对照组年龄(t=0.128)、是否绝经(χ2=0.038)差异均无统计学意义。本研究通过医学伦理委员会批准,所有受试者均已签署知情同意书。
1.2资料收集收集患者年龄、绝经情况、TNM分期、分子分型、Ki-67表达程度。从第1次诊疗开始,以电话方式每3个月随访1次,了解患者生存状况,包括疾病进展情况、生存状态等,随访截至2021年4月。
1.3治疗方案综合患者病理分期及分子分型,激素受体阳性(HR+)分为Luminal A型和Luminal B型。Luminal A型患者以手术+内分泌治疗为主;Luminal B型且人表皮生长因子受体-2(HER-2)阴性患者以手术+化疗+内分泌治疗为主,
Liminal B型且HER-2阳性患者以手术+化疗联合抗HER-2治疗+内分泌治疗为主;HER-2阳性患者以手术+化疗联合抗HER-2治疗为主;三阴性乳腺癌(TNBC)患者以手术+化疗为主。
靶心率计算公式1.4CellCollector®体内CTC检测利用CellCollector®(GILUPI GmbH,Potsdam,Germany)在乳腺癌组乳腺癌根治术或保乳术后进行至少1次外周血CTC检测,对照组入组后只接受1次CTC检测。采样针通过20G留置针穿刺入肘静脉,确保涂布有上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗体和防止白细胞(WBC)非特异吸附的水凝胶涂层的功能区暴露于外周血中。CTC采集完成后,将CellCollector®按照染色试剂盒说明书要求进行染色并鉴定,同时设有阴性对照恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞(NK-92)及阳性对照人乳腺癌细胞(MCF7)。分别通过WBC共同抗原CD45(EXBIO Praha,克隆号MEM-28-Alexa647)抗体、细胞角蛋白CK7/19/panCK抗体(EXBIO Praha,克隆号A53-B/A2-Alexa488)进行染色分析,然后通过Hoechst33342荧光染料(Sigma)进行核染色,同时结合细胞学形态鉴定所捕获的细胞是否为肿瘤细胞。其中,绿色信号为CK7/19/panCK阳性,蓝色信号为Hoechst33342阳性,红色信号为CD45阳性。CTC阳性判读标准:具有完整细胞形态且CD45-,CK7/19/panCK+,Hoechst33342+的细胞。CD45+,CK7/19/panCK-,Hoechst33342+则为WBC,见图1。
1.5统计学方法采用SPSS23.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据采用均值±标准差(x±s)表示,组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例表示,组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。
相关性分析采用Spearman法。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1乳腺癌患者基线CTC检测情况乳腺癌组基线CTC检出率为7
3.33%(44/60),范围1~46个,中位数为2个,26.67%(16/60)患者CTC数目≥5个。Ⅰ、
age,menopau,molecular typing and Ki-67expression.Among the24patients received twice CTC tests,the number of CTC incread in1of the4patients with dia progression.Of the20progression-free patients,the number of CTC incread in3patients,and there was no correlation between the dynamic changes of CTC number and dia progression. Conclusion The detection rate of CellCollector®in vivo CTC is higher in non metastatic breast cancer.It is possible for CTC to screen patients with breast cancer with higher metastatic risk.
Key words:breast neoplasms;neoplastic cells,circulating;CellCollector®;in vivo detection;dynamic monitoring
CTC
WBC
Merge梦见情人
CK7/19/panCK
Hoechst33342
CD45
Fig.1
Standard image of CTC detection in CellCollector ®(×100)图1
CellCollector ®体内CTC 检测判读标准图(×100)Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期乳腺癌患者CTC 阳性比例分别为
43.75%(7/16)、82.76%(24/29)、81.82%(9/11)和100%(4/4),Ⅰ~Ⅲ期乳腺癌患者CTC 检出率为71.43%(40/56)。各分期中≥5个CTC 的患者所占比例分别为2/16、9/29、3/11、2/4,各分期患者CTC 检出中位数分别为0个、2个、2个、4个。对照组未检测到CTC 。乳腺癌组患者CTC 阳性结果见图2。社会实践活动主题
2.2不同临床特征患者CTC 阳性率比较乳腺癌
患者不同临床分期下CTC 检出率差异有统计学意义(P <0.05),不同年龄、是否绝经、不同分子分型及Ki-67表达水平患者CTC 检出率差异均无统计学意义,见表1。
2.3CTC 动态监测结果及与疾病进展情况的相关性分析24例患者进行2次CTC 检测,其基线CTC 检出率为70.83%(17/24),CTC 数目范围0~13个,中位数2个,25.00%(6/24)患者CTC 数目≥5个;第2
次
Merge
CK7/19/panCK
Hoechst33342
CD45
患者1:30岁,未绝经,TNBC 型,Ki-67中表达(30%),临床分期为Ⅱ期,基线CTC 检测个数为1个;患者2:37岁,未绝经,HR +型,Ki-67低表达(5%),临床分期为Ⅱ期,基线CTC 检测个数为4个;患者3:62岁,已绝经,HR +型,Ki-67中表达(20%),临床分期为Ⅱ期,基线CTC 检测个数为1个
Fig.2
Reprentative image of CTC positive detection in CellCollector ®(×100)
图2
CellCollector ®体内CTC 检测阳性结果(×100
)
患者1
患者2
患者3
CTC检出率为62.50%(15/24),CTC数目范围0~9个,中位数1个,8.33%(2/24)患者CTC数目≥5个。随访4~19个月,50.00%(12/24)患者CTC数目降低,16.67%(4/24)患者CTC数目升高,33.33%(8/24)患者CTC数目不变。4例患者疾病发生进展,其基线均检出CTC,其中1例CTC数目增多,3例CTC数目降低。20例无疾病进展患者中,基线CTC检出率为65.00%(13/20),其中45%(9/20)患者CTC数目降低,40%(8/20)患者CTC数目不变,15%(3/20)患者CTC数目升高。Spearman相关性分析得出CTC数目动态变化与疾病进展不存在相关性(r s=-0.224,P>0.05)。
3讨论
CellCollector®使用EpCAM抗体特异性捕获CTC,其功能区的水凝胶涂层避免了WBC的非特异性富集,确保了捕获方法的特异性。相比于CellSearch TM体外检测技术,CellCollector®可检测约1500mL外周血,大大提高了CTC检出率[6]。一项注册临床试验入组127例转移性乳腺癌患者和63例良性乳腺疾病患者,采用CellCollector®对所有入组人员进行基线CTC检测,结果显示乳腺癌患者CTC 检出率为74.8%,良性组检出率为0,特异度为100%[12]。此外,CellCollector®的CTC检测具有安全性、稳定性和可重复性[11,13]。这些优势使得CellCollector®成为同时通过欧洲联盟(CE)和中国国家药品监督管理局(NMPA)批准的CTC体内捕获和鉴定技术。不论体内还是体外CTC检测,现有研究多为探究CTC与转移性乳腺癌患者的关系。Xie 等[6]采用CellCollector®检测38例转移性乳腺癌患者的CTC,结果显示CellCollector®检出率较高,且可以独立预测预后。本研究通过入组60例Ⅰ~Ⅳ期乳腺癌患者,探究基于CellCollector®检测的CTC在原发性乳腺癌患者中的应用价值。
本研究中所有患者基线CTC检出率为73.33%,对照组检出率为0,表明CellCollector®检测的CTC敏感度较高,且特异度为100%。本研究分析未发生转移的乳腺癌患者的CTC检出率,结果显示,Ⅰ~Ⅲ期患者中CTC检出率为71.43%,高于传统体外CTC检测技术CellSearch TM检出率的20%左右[8,10]。有研究发现CTC作为微小残留病灶可以识别出转移高风险人群[7,14]。在第8版《AJCC癌
症分期手册》中,CTC 已作为一个新的M分期(远端转移)标准被列为M0和M1之间的cM0(i+)分期[15]。Sparano等[7]研究发现,早期乳腺癌中CTC阳性患者较阴性患者相比复发风险高13.1倍,提示CTC辅助临床对患者进行复发转移风险分层有重要意义。本研究中Ⅰ~Ⅳ期检出率差异有统计学意义,这为辅助乳腺癌诊断,从而进行针对性治疗提供了新的依据。本研究中不同年龄、是否绝经、分子分型乳腺癌患者CTC检出率差异无统计学意义,与既往采用体外技术CellSearch TM检测CTC的研究结果一致[9,14]。Ki-67作为一种细胞增殖的核标志物,是反映肿瘤细胞增殖活性的重要指标[16]。但是,本研究中Ki-67表达>30%和≤15%乳腺癌患者CTC检出率的差异无统计学意义,因此需要大样本量的前瞻性研究来探讨验证两者的关系。
Schott等[17]研究指出,在治疗期间动态监测CTC 可以实时评估疗效,早期发现治疗敏感或耐药患者。《中国临床肿瘤学会乳腺癌诊疗指南2020》也提出,CTC可以动态监测疾病进展和预测预后,这对辅助临床决策,实现精准化治疗具有重要意义。本研究进一步探讨了CellCollect®体内技术捕获的CTC在治疗中的动态变化是否可以反映治疗效果,但并未发现CTC的动态变化与疾病进展具有相关性。
本研究为单中心的小样本研究,结果表明CellCollector®体内CTC检测技术用于Ⅰ~Ⅳ期乳腺癌患者有较高的检出率,这为CTC用于监测疾病早
临床特征
大亚人造板集团年龄
<50岁≥50岁
是否绝经
是
否
临床分期Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
分子分型HR+ HER-2+ TNBC
Ki-67
≤15%
>15%~30%>30%n
28
一首难忘的歌32
32
28
16
29
11
4
30
13
17
20
16
24
泰国禁忌
CTC阳性
21
23
22
22
7
24
9
4
21
10
13
13
13
18
χ2或P
0.075
0.737
0.023▲
0.864▲
1.257
Tab.1Comparison of positive CTC rates at baline between different clinical characteristics 表1不同临床特征下基线CTC阳性率比较(例)▲为Fisher确切概率法P值
期进展提供了更多支持。CTC与疾病进展的关系需要大规模的研究来进一步探讨分析。
参考文献
[1]郑荣寿,孙可欣,张思维,等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2019,41(1):19-28.Zheng RS,Sun KX,Zhang SW,et al.Report of cancer epidemiology in China,2015[J].Chin J Oncol,2019,41(1):19-28.doi:10.3760/cma.j. issn.0253-3766.2019.01.008.
[2]Early Breast Cancer Trialists'Collaborative Group(EBCTCG),Darby S,McGale P,et al.Effect of radiotherapy after breast-conrving surgery on10-year recurrence and15-year breast cancer death:meta-analysis of individual patient data for10,801 women in17randomid trials[J].Lancet,2011,378(9804):1707-1716.doi:10.1016/S0140-6736(11)61629-2.
[3]Lincu LA,Bonci EA,Irimie A,et al.The role of circulating tumor cells in chemoresistant metastatic breast cancer[J].J Clin Med,2021,10(4):684.doi:10.3390/jcm10040684.
[4]Sundling KE,Lowe AC.Circulating tumor cells:overview and opportunities in cytology[J].Adv Anat Pathol,2019,26(1):56-63.doi:10.1097/PAP.0000000000000217.
[5]王砚春,杨晓蓉,郭林,等.循环肿瘤细胞的“旧语新说”[J].国际检验医学杂志,2021,42(7):769-773.Wang YC,Yang XR,Guo L,et al."Old sayings and new sayings"of circulating tumor cells[J].Int J Lab Med,2021,42(7):769-773.
[6]Xie N,Hu Z,Tian C,et al.In vivo detection of CTC and CTC plakoglobin status helps predict prognosis in patients with metastatic breast cancer[J].Pathol Oncol Res,2020,26(4):2435-2442.doi:10.1007/s12253-020-00847-7.
离开的英文
[7]Sparano J,O'Neill A,Alpaugh K,et al.Association of circulating tumor cells with late recurrence of estrogen receptor-positive breast cancer:A condary analysis of a randomized clinical trial[J].JAMA Oncol,2018,4(12):1700-1706.doi:10.1001/jamaoncol.2018.2574.[8]Bilani N,Elson L,Liang H,et al.Prognostic and predictive value of circulating and disminated tumor cells in breast cancer:A national cancer data-ba(NCDB)analysis[J].Technol Cancer Res Treat,2020,19:1533033820980107.doi:10.1177/ 1533033820980107.
[9]Lucci A,Hall CS,Lodhi AK,et al.Circulating tumour cells in non-
metastatic breast cancer:a prospective study[J].Lancet Oncol,2012,13(7):688-695.doi:10.1016/S1470-2045(12)70209-7.[10]Alix-Panabières C,Pantel K.Challenges in circulating tumour cell rearch[J].Nat Rev Cancer,2014,14(9):623-631.doi:10.1038/ nrc3820.
[11]Saucedo-Zeni N,Mewes S,Niestroj R,et al.A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire [J].Int J Oncol,2012,41(4):1241-1250.doi:10.3892/ijo.2012. 1557.
[12]李健斌,耿翠芝,闫敏,等.循环肿瘤细胞采集仪捕集乳腺肿瘤患者循环上皮细胞的多中心临床
观察[J].中华医学杂志,2017,97(24):1857-1861.Li JB,Geng CZ,Yan M,et al.Multi-center cli-nical obrvation of circulating tumor cells captured by CellCollector in breast cancer patients[J].Chin Med J,2017,97(24):1857-1861.doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.24.003.[13]Gorges TM,Penkalla N,Schalk T,et al.Enumeration and molecular characterization of tumor cells in lung cancer patients using a novel in vivo device for capturing circulating tumor cells [J].Clin Cancer Res,2016,22(9):2197-2206.doi:10.1158/ 1078-0432.CCR-15-1416.报头
[14]Trapp E,Janni W,Schindlbeck C,et al.Prence of circulating tumor cells in high-risk early breast cancer during follow-up and prognosis[J].J Natl Cancer Inst2019,111(4):380-387.doi:10.1093/jnci/djy152.
[15]Bidard FC,Michiels S,Riethdorf S,et al.Circulating tumor cells in breast cancer patients treated by neoadjuvant chemotherapy:a meta-analysis[J].J Natl Cancer Inst,2018,110(2):560-567.doi:10.1093/jnci/djy018.
[16]Kim SY,Cho N,Choi Y,et al.Factors affecting pathologic complete respon following neoadjuvant chemotherapy in breast cancer:development and validation of a predictive nomogram[J].Radiology,2021,299(2):290-300.doi:10.1148/radiol202.1203871.
[17]Schott DS,Pizon M,Pachmann U,et al.Influence of adjuvant radiotherapy on circulating epithelial tumor cells and circulating cancer stem cells in primary non-metastatic breast cance[J]. Transl Oncol,2021,14(3):101009.doi:10.anon.2021. 101009.
(2021-03-30收稿2021-07-26修回)
(本文编辑李志芸)