单分子技术在G蛋白偶联受体二聚体中的应用
蔡欣; 王春勇; 王德秀; 苏文霞; 鲁洪; 王凤斌
【期刊名称】暗香疏影头像挂件《《中国药理学通报》》
【年(卷),期】2019(035)009雷锋日是几月几日
【总页数】6页(P1206-1211)
【关键词】沾沾自喜的拼音单分子技术; G蛋白偶联受体; 二聚体; 全内反射荧光显微镜; 受激发射损耗显微技术; 药物靶点运动减肥的正确方法
【作 者】蔡欣; 王春勇; 王德秀; 苏文霞; 鲁洪; 王凤斌
【作者单位】潍坊医学院临床医学院生理学教研室 山东 潍坊 261053; 寿光市人民医院肾内科 山东 寿光 262700
【正文语种】中 文
【中图分类】R-05; R341.3; R392.11; R446.8; R977.6
中班数学教案G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)构成最大的细胞膜受体超家族，是重要的药物靶点，其相关药物占市场上药物的40～50%。大量研究表明，GPCRs不仅能以单体的形式发挥生物学作用，也可以相互作用形成同源/异源二聚体，甚至高阶寡聚体，并具有独特的功能，如Apelin受体(putative receptor protein related to AT1，APJ)和血管紧张素1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)形成的异源二聚体，配体Apelin能通过该二聚体，抑制血管紧张素介导的动脉粥样硬化[1]。目前，GPCR二聚化的研究方法有很多，如免疫共沉淀、共振能量转移等，这些技术能隐藏“噪音”，平均计算GPCR二聚体的潜在差异和异常，衡量其不同物理或化学状态，但这些方法也隐藏了“噪音”中所含有的有价值信息，失去关于生物异质性的有用数据。如用于表达GPCRs的细胞，尽管培养的细胞具有遗传一致性，但本质上成分仍是异质的，这种异质性在物种进化上是非常重要的，能使生物体在波动的环境中迅速适应，给生物体带来生物优势，最终生存下来。但这些方法需要较高的受体表达水平，受体过表达可能改变生理特性，引起不依赖配体的受体激活等。相比较而言，单分子技术提供了一个直接的窗口，并能克服样品同步性的需求，通过记录受体复合物的荧光强度或追踪随着时间变化的运动轨迹，更详细和系统地研究细胞膜上GP
CR二聚体的亚单位组成、轨迹均方位移、扩散系数等，从而揭示罕见的中间状态和隐藏的动力学途径[2]，这些是GPCRs实现不同的新功能和多种生理功能所必需的基础，也是药物设计的重要靶点。本文将对研究GPCR二聚化的单分子技术进行简要综述。
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1 GPCR二聚体在药理学方面的重大潜力
传统观点认为，GPCRs的信号通路是线性的，即正位激动剂与受体的正位作用位点结合，激活G蛋白，引起一系列下游信号转导反应，但是由于正位作用位点保守性很强，正位激动剂与其结合的亲和力较大，因此目前很难对正位激动剂进行新药开发。近几十年，研究人员将目光转向了一种新作用位点——别构位点，别构调节剂与受体的别构位点结合，使受体构象发生变化，导致与该受体相互作用的蛋白功能改变，别构位点的出现不会影响正位激动剂与正位作用位点的结合，反而会调节正位激动剂的药理学作用。研究发现，在GPCR二聚化中，一个受体被刺激后，通过别构调节，调节另一个受体的正位配体的药理学特性，从而改变下游信号传导，如AT1R-B2R异源二聚化可增加AT1R对AngⅡ的反应性，这对先兆子痫综合症的发生起关键作用[3]。在GPCRs中，结构不对称会引起空间限制，影响信号复合体的排列，并最终在变构功能中发挥作用。单粒子追踪方法显示，A1/A
2AR异源二聚体以菱形排列，这种不对称结构对下游信号和功能具有重大影响。最近的一项研究发现，在Ghrelin受体和多巴胺D2受体(dopamine D2 receptor，D2R)形成异源二聚体中，Ghrelin受体作为变构调节剂，而不是信号受体，明显改变D2R的信号[4]，该结果可以解释异源二聚体在标准药物筛选中很难检测到的原因，其中一个受体可能只是另一个受体的变构调节剂，而不是作为信号受体传递自己的信号。
GPCR二聚体具有非常大的药物潜力，因此备受关注，其药理学作用也越来越受到重视。阿片类受体二聚体的药理学作用已被证明，研究发现，阿片受体的激动剂6′-Guanidinonaltrindole(GNTI)不能单独激活κ阿片受体(κ opioid receptor，κOR)或δOR，却能选择性地激活κOR-δOR异源二聚体，异源二聚体的组织特异性强，能够降低药物的副作用，将6′-GNTI注射到老鼠脊髓内可以观察到镇痛作用，所以κOR-δOR异源二聚体的研究有利于镇痛药的研发[5]。目前，作用于κOR-δOR异源二聚体的二价配体药物也在被研发，提供了潜在的新疗法。二价配体包含了通过间隔连接的κOR选择性拮抗剂5′-GNTI和δOR选择性拮抗剂纳曲吲哚(naltrindole)[6]。众所周知，α1肾上腺素能受体(α1 adrenergic receptor，α1AR)能够调节血管功能，在临床上可以靶向控制血压。最近研究表明，CXCR4的跨膜肽TMD2能够阻断CXCR4-α1AR二聚体的形成，从而抑制α1AR对血管平滑
肌收缩作用[7]。靶向GPCR二聚体的药物有望能够治疗多种疾病，虽然目前取得的成果不多，但随着GPCR二聚体知识的不断增长，会取得更多的成果。
2 GPCR二聚体的时空动态新型检测法——单分子技术
2.1 全内反射荧光显微技术(total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM) 对于所有分子来说，必须先通过细胞膜才能进出细胞，因此，在细胞膜上或附近发生着许多生物学过程。传统的显微镜技术(如荧光显微镜和激光共聚焦显微镜等)很难对这些过程进行成像，但TIRFM能够分析活细胞膜附近一些分子的定位情况和动力学过程，如膜蛋白定位、胞吞过程等。其原理是当一束光从光密介质进入光疏介质时，根据斯涅耳定律，一部分光会发生折射，而一部分光会发生反射，当入射角不断增大，折射角也会不断增大，当折射角刚好达到90度时，就发生了全反射现象。全反射发生后，光波不会被反射回第一介质，由于光的波粒二相性，其中一部分能量会进入折射率较小的介质，沿着折射面传播，这部分光我们称为隐失波，其能量在Z轴上呈指数衰减(Fig 1A)。因此，隐失波在照明样品时，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团，同时减弱来自胞内区域的荧光，使显微成像在Z轴上的空间分辨率得到明显改善，Z轴分辨率可达40～150 nm，大大提高了图像的信噪比[8]。
隐藏号码TIRFM能够提供纳米级的分辨率和极快速的成像，用于微小结构和单分子成像，如细胞膜上单个蛋白质动力学研究、细胞结构成像等。目前，应用TIRFM从单分子层次对GPCR二聚体的结构与功能进行研究，发现N-甲酰肽受体(N-formyl peptide receptor，FPR)同源二聚体的解离和2D结合速率分别为11.0 s-1和3.1[copies/μm2]s-1，在1 s内，FPR就能完成单体和二聚体相互转化的过程[9]。TIRFM与SNAP-tags技术联合使用，发现β-AR二聚体(20.5 ℃)寿命约为4 s，比FPR二聚体(37 ℃)长约40倍，比毒蕈碱M1受体二聚体(23 ℃)长约6倍[10]。由于膜蛋白的连续和随机运动，蛋白分子之间会发生随机碰撞，因此要控制分子的表达水平。本课题组利用TIRFM发现APJ能以单体、同源二聚体和寡聚体的形式存在，且在颗粒密度小于0.3颗粒/μm2的情况下，单体、二聚体和寡聚体分别占有不同比例。另外，单个APJ之间存在瞬时相互作用，不断形成和分解新的受体复合物[11](Fig 1B、1C)。
2.2 受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED)显微技术 虽然传统显微镜(如荧光显微镜和激光共聚焦显微镜等)和TIRFM能够解决生命科学领域的很多问题，但是衍射现象限制了他们的空间分辨率，衍射极限可用Abbe′s law量化[12]，公式如下：dx,y=λ/2NA；dz=2λ/NA2。dx,y指的是横向分辨率，dz指的是纵向分辨率，λ为激发光波长，NA为显微
镜物镜的数值孔径。根据公式，能够清晰地计算出最高横向分辨率为180 nm，最高纵向分辨率为500 nm。Hell等在1994年提出STED概念，于2014年获得诺贝尔奖[13]。该技术能够突破这种衍射极限，Z轴分辨率可达40～150 nm，具有很大的发展潜力。其原理是样品被两束激光以高强度脉冲形式照射，第1束激光(Exc beam)用于激发荧光分子，第2束激光(STED beam)用于损耗荧光分子，将荧光分子的周围从受激状态返回到基态。损耗激光的光路产生1个呈圆环型的能量分布，即圆环型的STED光，从而大大缩小有效的荧光检测区域，使样品发射荧光的体积限制在非常小的范围内，只能检测没有完全损耗的荧光分子的中心，从而提高分辨率。这一技术可用于活细胞和固定样品的成像，在一些生物学和医学研究中发挥了重要作用，如细胞膜上和泡囊中蛋白质的分布与动态过程等。Van Laar等[14]利用STED，研究轴突内线粒体与内质网接触部位处线粒体DNA的复制，发现在帕金森相关应激条件下，线粒体生物发生会根据解剖分区的方式不同而改变，有助于神经退行性疾病的治疗。STED具有多种类型，如多色STED、脉冲STED、连续波[continuous-wave(CW)]STED和Gate STED等[15]。多色STED通过添加多个Exc beam和利用同一STED beam进行，激光束具有不同的激发光谱，但是具有相似的发射尾。脉冲STED使用脉冲式的激发光和损耗光，在短时间内发出大量的激发光，从而有效地将荧光分子周围的
荧光淬灭，提高空间分辨率。一般来说，激发光的脉冲比损耗光的脉冲要短，损耗光的脉冲比荧光分子的振动驰豫的时间要长，但是比荧光分子的寿命要短。脉冲STED的优点是损耗时只需相对较低的平均功率；而且，由于较低重复频率的使用，荧光在被激发之前，在三重态驰豫中就能发出荧光，从而减少了光漂白[16]。另外，由于一些荧光的自发光能够忽略掉脉冲激光，所以连续的激光仍在被使用，CW STED用连续激光(可见光和近红外光)代替脉冲激光，降低了系统的复杂性(不需要脉冲光)和费用，增加系统的用途。CW STED中，荧光在激发状态呆的时间越长，损耗光将该荧光从受激状态返回到基态的可能性就越大，但是由于连续激光的峰强度较低，所以分辨率比脉冲STED的分辨率较低。为了解决这个问题，Gate STED应运而生，该技术将CW STED与时间门控检测联系起来，CW STED中，荧光分子被激活后，延迟一段时间后再收集荧光，那么淬灭荧光的相对概率将升高，原因是损耗光对荧光的耗损依赖于在激发态下荧光团暴露的光子数量，荧光光子在荧光团激发之后被收集，这就确保所收集的荧光源已经处于激发态至少一段时间。而时间门控可以忽略掉早期荧光的发射光子，激发荧光和收集荧光之间延迟的时间越长，越可以确保记录的主要是荧光中心的荧光团，有效空间分辨率越高(Tab 1)。
Fig 1 Asssment of GPCR dimer with TIRFM A:Principle of TIRFM. n1(refractive index
of the sample) is less than n2(refractive index of the cover slip). The excitation beam enters from the left at incidence angle(θ), which is greater than the critical angle c(θc). The excitation beam is reflected off the cover-slip-sample interface and an evanescent field is generated on the opposite side of the interface in the sample. Only fluorophores in the evanescent field are excited, as indicated by the green particles; B: TIRFM image of cells expressing APJ-GFP; C: Single-molecule co-tracking of APJ homodimers by TIRFM.
2.3 单分子定位显微技术 单分子定位显微技术，如基态耗尽显微术(ground state depletion，GSD)、光敏定位显微术(photoactivatable localization microscopy，PALM) 和随机光学重建显微术(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，能连续激活和定位荧光，从而避免光的衍射极限，主要原理是荧光信号以单分子的形式被激活，通过函数拟合，计算出单分子荧光光斑的中央位点，经过上万次循环的依次激活和计算，从而得出完整的超高分辨率图像，分辨率高达10～75 nm。该类技术缺点是需要对批量图片进行后处理算法，因而有可能产生假象。GSD通过减少同时发射荧光团的数目来克服衍射极限，成像速度为2～10 min/幅，高能激光激发荧光团标记的样品，光子轰击电子，增加“自旋翻转”的概率，使荧光团由激发态进入三重态或“暗态”，在三重态中，荧光团不发射
光子，样品显得更暗，有效地耗尽了基态，因此命名为“GSD”[17]。这些荧光团可以随机地返回到基态，并且可以在返回到三重态之前，经历激发到基态跃迁的多个光子发射，在任何给定时间内，单个荧光团发射的光子在空间和时间上与相邻的荧光团不同。光子的爆发可以与高斯函数拟合，计算的质心对应于荧光团的位置，定位精度取决于透镜的数值孔径、激发光的波长和每个荧光团发射的光子数量[3]。GSD在任何时间只有一组荧光团主动发射，所以必须几分钟内收集数以千计的图像，从而建立一个完整的定位图，由于较长的采集时间与高功率激光，GSD更适合于固定的而不是活的样品。
