第42卷第3期2021年5月
Vol.42No.3
May2021中山大学学报（医学科学版）
黑白插画JOURNAL OF SUN YAT⁃SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）
SDF-1/CXCR4激活ERK和PI3K/AKT通路介导髓核
致炎根性疼痛
魏明1，高凤娇1，杨琳2，孙来保1，邹学农3，黄文起1
（1.中山大学附属第一医院麻醉科，广东广州510080；2.番禺区中心医院麻醉科，广东广州511400；
3.广东省骨科学重点实验室，广东广州510700）会计学习计划
和女朋友怎么聊天摘要：【目的】探讨基质细胞衍生因子1/趋化因子CXC受体4（SDF-1/CXCR4）通路在髓核致炎根性疼痛中的作用及机制。【方法】分为三部分：①26只大鼠随机分为假手术组和模型组，分别行假手术或髓核自体移植。Von Frey纤维丝测量大鼠机械撤足阈值（PWT）的变化；Western blot法检测大鼠脊髓中S
DF-1、CXCR4，磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）和磷酸化蛋白激酶B（pAKT）表达水平；免疫荧光染色定位SDF-1、CXCR4的表达细胞。②54只大鼠随机分为假手术组、模型组、溶剂组、AMD3100组、SDF-1中和抗体组、对照Ig G组。鞘内注射相应药物，
测量大鼠PWT的变化和大鼠脊髓中pERK和pAKT的表达变化。③18只大鼠随机分为溶剂组、U0126组、LY294002组，鞘内注射相应药物，测量大鼠PWT的变化。【结果】①髓核自体移植使大鼠PWT下降（P＜0.001），脊髓中SDF-1、CXCR4、pERK，pAKT表达上调（P＜0.05），SDF-1主要与脊髓中神经元共表达，CXCR4与神经元和星形胶质细胞共表达。②鞘内注射SDF-1中和抗体或CXCR4抑制剂AMD3100升高髓核自体移植大鼠的PWT（P＜0.05），并使髓核自体移植大鼠脊髓中pERK和pAKT表达下调（P＜0.05）。③鞘内给予MEK抑制剂U0126或PI3K
抑制剂LY294002可升高髓核自体移植大鼠PWT（P＜0.05）。【结论】SDF-1/CXCR4通过激活ERK和PI3K/AKT通路介导髓核致炎根性疼痛。
关键词：腰椎间盘突出症；髓核；根性疼痛；基质细胞衍生因子1；CXCR4
中图分类号：R364.5文献标志码：A文章编号：1672-3554（2021）03-0373-08
DOI：10.ki.j.sun.yat-n.univ（med.sci）.2021.0107
SDF-1/CXCR4Activates ERK and PI3K/AKT Signaling Contributing to the Pathogenesis of Radicular Pain Induced by Autograft of Nucleus Pulposus
WEI Ming1，GAO Feng-jiao1，YANG Lin2，SUN Lai-bao1，ZOU Xue-nong3，HUANG Wen-qi1（1.Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-n University，Guangzhou510080，China；
2.Department of Anesthesiology，Panyu Central Hospital，Guangzhou511400，China；
曼娜回忆录全文3.Guangdong Provincial Key
Laboratory of Orthopedics and Traumatology，Guangzhou510700，China）
Correspondence to：HUANG Wen-qi；E-mail：*****************.
Abstract：【Objective】To investigate the effect and mechanism of SDF-1/CXCR4in radicular pain induced by auto⁃graft of nucleus pulposus.【Methods】Three parts were included.①26rats were randomly divided into sham group and model group.Autograft of nucleus pulposus was done in model group.Paw withdrawal threshold（PWT）was tested by von Fray filaments.The expression of SDF-1，CXCR4，pERK and pAKT of spinal cord was tested by western blot.Immunoflu⁃orescence
staining was ud to locate the expression of SDF-1and CXCR4.②54rats were randomly and equally divided
收稿日期：2021-03-18
基金项目：广州市卫生局西医类研究项目（20201A01119）；广州市中药局研究项目（20202A010026）
作者简介：魏明，硕士，主治医师，研究方向：临床麻醉与疼痛诊疗，E-mail：*****************；黄文起，通信作者，主任医师，研究方向：麻醉学，E-mail：*****************.
第42卷
中山大学学报（医学科学版）
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into sham group，model group，vehicle group，SDF-1neutralizing antibody group，AMD3100group，and isotype IgG group.Drug was administered intrathecally.PWT and the expression of pERK and pAKT of spinal cord were tested.③18 rats were randomly and equally divided into model group，U0126group and LY294002group.Drug was administered intra⁃thecally.PWT was tested.【Results】①Autologous nucleus pulposus transplantation in rats red
uced PWT（P＜0.001）and incread the expressions of SDF-1，CXCR4，pERK and pAKT in spinal cord of rats（P＜0.05）.SDF-1was mainly co-expresd with neuron，while CXCR4was co-expresd with neuron and astrocyte.②SDF-1neutralizing antibody and CXCR4inhibitor AMD3100reduced PWT（P＜0.05）.The expression of pERK and pAKT in spinal cord of SDF-1neutral⁃izing antibody group and AMD3100group was reduced（P＜0.05）.③Intrathecally administration of MEK inhibitor U0126or PI3K inhibitor LY294002reduced PWT（P＜0.05）.【Conclusion】SDF-1/CXCR4activates ERK and PI3K/AKT signaling，which contributes to the pathogenesis of radicular pain induced by autograft of nucleus pulposus.
Key words：lumbar disc herniation；nucleus pulposus；radicular pain；SDF-1；CXCR4
［J SUN Yat⁃n Univ（Med Sci），2021，42（3）：373-380］
根性疼痛是指脊神经的背根和/或背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）受到刺激而引起的疼痛。它是腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，
LDH）最常见的临床症状［1］。LDH导致根性疼痛的机制有机械压迫学说、炎症免疫学说等，其中炎症免疫学说越来越受到重视。突出的髓核组织可引起化学刺激，并诱发炎症免疫反应产生IL-6、IL-1β、TNF-α等细胞因子，刺激传入神经纤维，导致痛觉的外周敏化；同时这些因子在脊髓中表达上调，
导致痛觉的中枢敏化［2］。但目前LDH导致根性疼痛的确切机制并不完全清楚。基质细胞衍生因子1（stromal cell derived factor-1，SDF-1），因最初发现由骨髓基质细胞分泌而得名，它又称趋化因子CXC配体12（chemokine CXC ligand12，CX⁃CL12）。趋化因子CXC受体4（CXCR4）是SDF-1的特异性受体。SDF-1与CXCR4广泛地表达于多种细胞和组织中，并在炎症、肿瘤等疾病中起着至关重要的作用［3］。文献报道，在完全弗式佐剂诱导炎性痛模型［4］、癌痛模型［5-6］、术后急性切口痛模型［7］中，阻断SDF-1/CXCR4信号通路可以减轻模型的痛觉过敏，这提示SDF-1/CXCR4信号通路参与了多种类型疼痛的发生机制。研究表明，SDF-1/ CXCR4是通过激活细胞外信号调节激酶（extracel⁃lular signal-regulated kina，ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kina/protein kina B，PI3K/AKT）通路发挥作用：大鼠足跖切口急性疼痛模型中，SDF-1/CXCR4可激活ERK通路，但不激活PI3K/AKT通路［7］；蜜蜂毒注射痛敏预点燃模型中，SDF-1/CXCR4同时激活ERK和PI3K/AKT通路［8］。可见在不同的疼痛模型中，SDF-1/ CXCR4对ERK和PI3K/AKT通路的作用是不一样的。目前，在髓核致炎根性疼痛的发病机制中，SDF-1/CXCR4是否参与，其是否通过激活ERK和PI3K/AKT通路发挥作用尚无报道。本研究旨在探讨SDF-1/CXCR4通路在髓核致炎根性痛大鼠模型中的作用及其机制，为阐明LDH引起根性疼痛的发病机制提供新的实验依据。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
SDF-1、GAPDH、Tubulin、GFAP、Neun、CD11b 一抗，HRP标记的IgG二抗，对照IgG（abcam，美国）；CXCR4、磷酸化ERK（Phospho-ERK，pERK）、磷酸化AKT（Phospho-AKT，pAKT）一抗（Affinity，中国）；FITC荧光二抗（Invitrogen，美国）；SDF-1中和抗体（US Biological，美国）；AMD3100、U0126、LY294002（MCE，中国）；二甲基亚砜（dimethyl sulf⁃oxide，DMSO，Sigma，美国）；Von Frey纤维丝（Stoelting，美国）；Biorad ChemiDoc MP凝胶成像系统（Biorad，美国）；倒置荧光显微镜（Leica，美国）；PE-10导管（Smiths medical，英国）。溜冰鞋教程
1.2实验动物
SPF级雄性SD大鼠（200~280g）由中山大学动物实验中心提供，许可证号SCXK（粤）2016-0029。分笼饲养，自由进食，室温（23±2）℃，相对湿度55%~65%，维持大鼠12h/12h昼夜节律。本研究所有实验操作均符合中山大学动物实验中心伦理
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第3期魏明，等.SDF-1/CXCR4激活ERK和PI3K/AKT通路介导髓核致炎根性疼痛
委员会要求并按照实验动物使用原则进行。1.3实验分组
本研究分为三个部分。实验一：26只大鼠随机分为模型组和假手术组。检测每组6只大鼠手术前后的机械撤足阈值（paw withdrawl threshold，PWT）变化；假手术组术后第14天和模型组术后第3、7、14天各3只大鼠术后脊髓SDF-1、CXCR4、pERK，pAKT表达变化；模型组2只大鼠脊髓行免疫荧光化学染色将SDF-1、CXCR4分别与星形胶质细胞标志蛋白GFAP、小胶质细胞标志蛋白CD11b 和神经元标志蛋白Neun共染。实验二：54只大鼠随机分为假手术组、模型组、溶剂组、AMD3100组、SDF-1中和抗体组、对照IgG组，分别行假手术、建模、建模后连续5d鞘内注射50g/L DMSO10uL、CXCR4抑制剂AMD310010μg、SDF-1中和抗体5μg，对照组Ig G5μg（给药剂量参考文献报道［9-10］和预实验结果）。检测每组6只大鼠手术前后的PWT 变化；每组3只大鼠检测脊髓中pERK和pAKT表达变化。实验三：18只大鼠随机分为溶剂组、U0126组、LY294002组，分别建模后连续5d鞘内注射50 g/L DMSO10μL、MEK的抑制剂U012610μg，PI3K 抑制剂LY29400210μg（给药剂量参考文献报道［9-11］和预实验结果）。检测每组6只大鼠手术前后的PWT变化。
1.4鞘内置管
在实验二和实验三中，在假手术和建模前，参照Liu等［12］描述的方法对大鼠进行鞘内置管。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（50mg/kg，ip.），切开皮肤暴露L3~4椎间隙，将PE-10导管向头侧置入约2cm到达腰膨大水平。将导管经皮下隧道固定至大鼠头部两耳之间，关闭切口。术后剔除手术损伤致下肢运动功能障碍的大鼠，并于鞘内注射2%利多卡因10μL以验证导管位置，剔除导管位置错误的大
鼠。鞘内置管手术后5d再进行后续实验。1.5模型建立
参考文献［13］建立动物模型。用戊巴比妥钠麻醉大鼠（50mg/kg，ip.），在髂嵴附近做正中纵切口，顿性分离左侧椎旁肌，切除行L5和L6关节突关节和L5椎板，暴露L5DRG。取尾椎2个节段自体髓核。模型组将获取的髓核组织覆盖于左侧L5 DRG。假手术组仅行L5DRG的暴露，取尾部髓核组织但不将其置于L5DRG。逐层缝合组织关闭切口。1.6PWT的测定
将大鼠放置在箱底为金属网的透明有机玻璃箱中至少15min，使其充分适应测试环境并处于安静状态。采用Up-Down方法［14］，用Von Frey纤维丝（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14g）对大鼠后肢左脚足心部进行机械性刺激，每次刺激持续时间为6~8s。大鼠在刺激时间内或撤离刺激时出现撤足或舔足现象，则为阳性反应。以2.041g 刺激强度为初始刺激强度，若撤足反应为阳性，则选择相邻递减的刺激强度给予刺激；若撤足反应为阴性，则选择相邻递增的刺激强度给予刺激。以第一个转折点的前一点为起点连续6次的刺激结果。使用计算机程序根据测试计算出PWT。
1.7Western Blot实验
实验一术后第3、7、14天，每组3只大鼠用于检测蛋白表达。实验二中术后第7天每组3只大鼠检测pERK、pAKT表达变化。戊巴比妥钠（70mg/kg，ip.）深麻醉大鼠后断头处死，在冰面上迅速取出大鼠L4-L6节段脊髓。加入蛋白裂解液，匀浆和裂解30min，裂解后的样品4°C14000g离心10min，取上
清液，行BCA法蛋白定量。配平并变性蛋白。SDS-PAGE胶电泳分离蛋白后转至PVDF膜。5% BSA中封闭1h，随后加入一抗孵育，4˚C过夜。漂洗后加入相应的二抗室温孵育1h。洗膜后加入ECL发光液显色曝光。使用Biorad ChemiDoc MP 凝胶成像系统进行显色拍照，最后采用Image J进行条带的灰度分析。
1.8免疫荧光实验
用2%戊巴比妥（60~80mg/kg）深度麻醉大鼠后，经主动脉快速灌注200mL生理盐水后，继而40g/L多聚甲醛灌注固定30min。将L4~6脊髓节段取出，40g/L多聚甲醛后固定24h，然后依次用10%、20%和30%蔗糖溶液梯度脱水3d。做连续冠状冰冻切片（20μm/片），切片漂洗、封闭后加入一抗，4℃孵育12h，漂洗后加入荧光二抗，室温孵育2h。漂洗、裱片、封片，加入抗荧光淬灭剂后在倒置荧光显微镜下观察摄片。
1.9统计学分析
统计学分析通过SPSS20.0（SPSS Inc.，USA）进行，所有数据表示为均数±标准差。PWT数据应用重复测量的方差分析检验差异。对Western Blot数据采用单因素方差分析进行检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
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第42卷
中山大学学报（医学科学版）2
结果
月寒2.1
髓核自体移植导致大鼠机械痛敏，脊髓中
SDF-1、CXCR4、pERK、pAKT 表达上调
PWT 测试结果显示（图1A ）：经重复测量方差
分析，模型组与假手术组间差异有统计学意义（F=
54.55，P <0.001；F=703.9，P <0.001）；进一步采用Si⁃dak 法作两两比较发现，模型组术后第1、3、7、14、
21天PWT 较术前降低（P 均<0.001），且与假手组比较有统计学差异（P 均<0.001）。Western blot 结果显示（图2A-D ）：经单因素方差分析，模型组SDF-1、CXCR4、pERK 、pAKT 蛋白表达与假手
术组比较有统计学差异（F=15.98，P =0.045；F=26.37，P =0.035；F=82.87，P =0.008；F=65.04，P =0.010），进一
步两两比较发现模型组SDF-1、CXCR4、pERK ，pAKT 蛋白术后比假手术组表达上调（术后第3天P =0.029，P =0.016，P =0.006，P <0.001；术后第7天P =0.035，P =0.022，P =0.003，P =0.015；术后第14天P =0.031，P =0.021，P =0.011，P =0.001）。免疫荧光双染结果显示，SDF-1主要在神经元分布（图3），而CX⁃
CR4主要在神经元和星形胶质细胞分布（图4）。2.2
鞘内注射SDF-1中和性抗体或CXCR4抑制剂AMD3100减轻髓核自体移植引起的痛觉过敏，并下调脊髓中pERK、pAKT 表达水平
PWT 测试结果显示（图1B ）：经重复测量方差
分析，各组间差异有统计学意义（F=188.9，P <
0.001；F=76.21，P <0.001）；进一步采用Sidak 法作两两比较发现，模型组、溶剂组和对照Ig G 组PWT 在术后第1、3、5、7天比假手组降低（P 均<0.001）；AMD3100组和SDF-1中和抗体组的PWT 比模型组
（第3天：P <0.001vs.AMD3100组或SDF-1中和抗体组；第5天：P <0.001vs.AMD3100组，P =0.008vs.SDF-1中和抗体组；第7天：P <0.001vs.AMD3100组，P =0.004vs.SDF-1中和抗体组），溶剂组（第3、5天：P 均<0.001vs.AMD3100组或SDF-1中和抗体组；第7天：P <0.001vs.AMD3100组，P =0.004vs.SDF-1中和抗体组）或对照Ig G 组（第3、5、7天：P 均<0.001vs.AMD3100组或SDF-1中和抗体组）提高；与假手术组比较，AMD3100组和SDF-1中和抗
体组的PWT 仍下降（P 均<0.001）。Western blot 结果显示（图2E ，F ）：经单因素方差分析，各组间pERK （F=29.91，P <0.001）和pAKT （F=38.37，P <0.001）差异有统计学意义；进一步两两比较发现，模型组和溶剂组中pERK 和pAKT 比假手术组表达上调（P 均<0.001）；与模型组或溶剂组比较，AMD3100组pERK （P =0.001vs .模型组，P =0.003vs .溶剂组）和pAKT （P <0.001vs .模型组，P =0.001vs .溶剂组）表达下调；与模型组或溶剂组比较，SDF-1中和抗体组的pERK （P =0.002vs .模型组，P =0.005vs .溶剂组）和pAKT （P 均<0.001）表达下调；与假手术组比较，AMD3100组和SDF-1中和抗体组的pERK （P =0.048，P =0.029）和pAKT （P =0.014，P =0.040）表
达仍上调。
PWT for rats was tested in different groups.A:1)P <0.001compared with sham group or baline by Sidak-t after two-way ANOVA;n =6per group.
B:1)P <0.001compared with sham group;2)P <0.01compared with model group or vehicle group,or Ig G group by Sidak-t after two-way ANOVA;n =6per group.C:1)P <0.05，2）P <0.01compared with sham group by Sidak -t after two-way ANOVA;n =6per group.
图1各组大鼠PWT 变化情况
Fig.1PWT for rats in different groups
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第3期魏明，等.SDF-1/CXCR4激活ERK 和PI3K/AKT 通路介导髓核致炎根性疼痛
2.3
鞘内注射MEK 的抑制剂U0126或PI3K 抑制
剂LY294002减轻髓核自体移植引起的痛觉过敏
PWT 测试结果显示（图1C ）：经重复测量方差
分析，各组间差异有统计学意义（F=88.58，P <0.001；F=15.7，P <0.001）；进一步采用Sidak 法作两两比较发现，与溶剂组相比U0126组和LY294002组PWT 在术后升高（术后第3天：P =0.04，P =0.001；术后第5天P =0.009，P =0.04；术后第7天：P =0.008，P =0.005）。
3讨论
SDF-1/CXCR4通路被证明参与多种类型疼痛
的形成和发展。有研究结果显示，大鼠单次足底或
鞘内注射SDF-1后可出现持续的痛觉过敏，给予
CXCR4的siRNA 或AMD 3100可减轻痛敏［15］；在神经病理性疼痛的模型如坐骨神经分支选择切断
大鼠模型或坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠模型中，其DRG 及脊髓中SDF-1和CXCR4的表达均发生上调，在鞘内注射SDF-1中和抗体或AMD3100可减
轻模型的痛敏［16-17］；另外，在完全弗式佐剂诱导炎性痛模型［4］、癌痛模型［5-6］、术后急性切口痛模型［7］、再缺血再灌注疼痛模型［18］，化疗药引起的疼痛［10-19］等模型中，均有报道显示SDF-1/CXCR4参与了痛敏的形成和发展。但目前文献中尚无SDF-1/CX⁃CR4在髓核致炎根性疼痛模型中作用的相关报道。
在本研究中，鞘内给予SDF-1中和抗体或CXCR4抑制剂AMD3100阻断SDF-1/CXC4
信号通路可减Western blot shows that the expression of SDF-1(A),CXCR4(B),pERK (C),pAKT (D)in the spinal cord of model group was upregulated,1)P <
0.05,2)P <0.01,3)P <0.001compared with sham group by Tukey-t after ANOVA;n =3per group.SDF-1neutralizing antibody and AMD3100reduced upregulation of pERK (E)and pAKT (F)in the spinal cord of nucleus pulposus autograft rats,1)P <0.05,2)P <0.001compared with sham group,3)P <
0.01compared with model group or vehicle group by Tukey-t after ANOVA;n =3per group.
图2各组大鼠脊髓蛋白表达情况
Fig.2Protein expression in spinal cord of rats in different groups
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