虎头燕颔
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2021.23.002
依托咪酯对DNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎氧化应激和炎症因子表达的干预及机制研究①
李曦吴仲代丽娜李仕梅王子明②许凌懿孔航③
（贵州中医药大学第一附属医院麻醉科，贵阳550001）
中图分类号R541.9文献标志码A文章编号1000-484X（2021）23-2822-06
［摘要］目的：本文旨在探究依托咪酯（Eto）对2，4-二硝基苯磺酸（DNBS）诱导的大鼠溃疡性结肠炎（UC）的保护作用及相关机制。方法：将40只SPF级Wistar大鼠随机分为5组，对照组、模型组、依托咪酯低剂量组（1.5mg/kg）、中剂量组（3mg/kg）、高剂量组（6mg/kg）。采用DNBS诱导法构建溃疡性结肠炎大鼠模型，观察记录病变活动指数（DAI）和结肠黏膜损伤指数（CMDI）。HE染色观察结肠组织病理状态并进行结肠组织学评分（HS）。TUNEL染色检测细胞凋亡，Western blot检测
Bax和Bcl-2的表达。试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平，Western blot检测p-P65的表达。结果：与对照组相比，DNBS诱导组DAI指数、CMDI指数和HS评分显著增加（P<0.05），出现结肠水肿溃烂，大面积溃疡灶，大量炎症细胞浸
润等UC的组织病理学改变，UC大鼠模型构建成功。UC大鼠结肠组织细胞凋亡率及Bax/Bcl-2显著上调（P<0.05），SOD水平明显下调，MDA水平明显上调（P<0.05），IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子水平及NF-κB p-P65水平显著上调（P<0.05）。与模型组相比，Eto中、高剂量组DAI指数、CMDI指数和HS评分显著降低（P<0.05），且病理学改变明显减轻，Eto中、高剂量组呈剂量依赖性显著下调细胞凋亡率及Bax/Bcl-2（P<0.05），上调SOD水平，下调MDA水平（P< 0.05），IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子水平及NF-κB p-P65水平显著下调（P<0.05），Eto低剂量组差异无统计学意义。结论：Eto对DNBS诱导的大鼠UC有明显保护作用，其保护机制为抑制氧化应激和炎症反应及细胞凋亡。
胸小的好处［关键词］依托咪酯；DNBS；溃疡性结肠炎；氧化应激；炎症
Intervention mechanism of etomidate on DNBS-induced oxidative stress and inflammatory factor expression in ulcerative colitis in rats
LI Xi，WU Zhong，DAI Li-Na，LI Shi-Mei，WANG Zi-Ming，XU Ling-Yi，KONG Hang.Department of Anesthesio-logy，the First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chine Medicine，Guiyang550001，China ［Abstract］Objective：The purpo of this article is to investigate the protection effects of etomidate（Eto）on2，4-dinitroben‐zene sulfonic acid（DNBS）
-induced ulcerative colitis（UC）in rats and related mechanisms.Methods：Forty SPF Wistar rats were ran‐domly divided into5groups：normal group，model group，low-do etomidate group（1.5mg/kg），medium-do group（3mg/kg），high-do group（6mg/kg）.The DNBS induction method was ud to construct a rat model of ulcerative colitis，the dia activity index（DAI）and colonic mucosal damage index（CMDI）were obrved and recorded.HE staining was ud to obrve the pathological state of the colon tissue and a colon histopathological score（HS）was performed.TUNEL staining was ud to detect apoptosis，and Western blot was ud to detect the expression of Bax and Bcl-2.The kit was ud to detect the levels of superoxide dismuta （SOD）and malondialdehyde（MDA），ELISA to detect the expression levels of IL-1β，IL-6and TNF-α，and Western blot to detect the expression of p-P65.Results：Compared with the control group，the DAI index，CMDI index and HS score of the DNBS-induced group were significantly incread（P<0.05），histopathology change of ulcerative colitis such as colonic edema ulceration，large-area ulcer foci，and a large number of inflammatory cell infiltration，the UC rat model was successfully constructed.Apoptosis rate and Bax/Bcl-2ratio in colon tissue of UC rats were significantly incread（P<0.05），SOD level was significantly decread，MDA level was significantly incread（P<0.05），the levels of IL-1β，IL-6，TNF-αinflammatory factors and NF-κB p-P65were significantly incread（P<0.05）.Compared with the model group，the DAI index，CM
DI index and HS score of the Eto medium and high do groups were significantly reduced（P<0.05），and the pathological changes were significantly reduced.The Eto medium and high do groups significantly down-regulated apoptosis rate in a do-dependent manner and Bax/Bcl-2（P<0.05），up-regulated SOD level，
①本文为贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题（QZYY-2019-009）。
②贵州中医药大学第一附属医院肛肠科，贵阳550001。
③贵州省贵阳市第一人民医院麻醉科，贵阳550002。
作者简介：李曦，女，副主任医师，主要从事临床麻醉研究，E-mail：。
down-regulated MDA level（P<0.05），IL-1β，IL-6，TNF-αinflammatory factor levels and NF-κB p-P65levels were significant down-regulated（P<0.05），Eto low-do group had no statistical difference.Conclusion：Eto has a significant protective effect on DNBS-induced UC in rats，and its protective mechanism is to inhibit oxidative stress，inflammation and apoptosis.
［Key words］Etomidate；DNBS；Ulcerative colitis；Oxidative stress；Inflammation
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性大肠黏膜炎症，尤其影响结肠和直肠，其特点为间歇性的复发，之后缓解，随后导致黏膜损伤［1-3］。
UC主要累及结肠和直肠的远端黏膜，导致结肠疼痛、溃疡、水肿、血性腹泻、液体和电解质减少以及体重减轻等症状［4-6］。持续性UC增加结肠癌的风险，它是炎症性肠病（inflammatory bowel dias，IBD）的主要类型之一，是环境和遗传因素相互作用的结果，导致免疫反应和肠道炎症［7-8］。UC的发病率和流行率在全球范围内呈上升趋势，一项研究报告显示每10万人中有1.0至15.0例UC患者［9］。UC 的传统治疗方法包括5-氨基水杨酸、硫嘌呤和皮质类固醇［10-12］。免疫调节剂包括钙调磷酸酶抑制剂，如环孢菌素和他克莫司也被证明对UC有益［3］。然而这些药物伴随着严重的副作用，治疗效果也不理想。因此，有必要寻找新的治疗药物来有效地控制UC的症状和并发症。依托咪酯（Etomidate，Eto），是一种短效的非巴比妥酸盐类催眠药，与其他药物（如丙泊酚或咪达唑仑）相比，具有稳定心血管和减少呼吸抑制的优势［13-14］。因此多年来一直是低血压患者的首选诱导剂［15］。但使用Eto也有一定的副作用，比如肌阵挛和肾上腺皮质功能抑制等不良反应［16］。研究表明丙泊酚和Eto联合应用可有效降低机体应激反应和炎症反应，提高胃肠镜检过程中的安全性［17］。本文主要探究了Eto对DNBS诱导的UC 大鼠氧化应激及炎症反应的影响。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂Eto、2，4-二硝基苯磺酸（2，4-dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）购自美国Sigma 公司；IL-6、IL-1β、TNF-αELISA试剂盒购自美国R&D公司；抗Bax，Bcl-2抗体购自英国Abcam公司；抗NF-κB p65（p-P65）抗体及辣根酶（HRP）标记二抗购自上海赛信通生物试剂有限公司；Nanodrop2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）；TUNEL试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismuta，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒购自北京索莱宝公司。
1.1.2实验动物40只健康SPF级Wistar大鼠，8~ 10周龄，平均体质量（200±20）g，购自中国食品药品检定研究所实验动物资源研究所，合格证号SCXK （京）2014-0013。将动物圈养在温度可控的房间中，光照时间为12h，温度为22℃~24℃，湿度为50%~ 60％，标准的实验室食物和任意的自来水喂养，实验前饲养1周使动物适应环境条件。
1.2方法
1.2.1DNBS结肠炎的诱导［18］禁食12h后，用10%氯胺酮（50mg/kg）和2%二甲苯嗪（5mg/kg）麻醉动物，将30mg的DNBS溶解在250μl乙醇（50%v/v）中，在距每只动物肛门8cm处用聚四氟乙烯导管进行结肠内给药，并且倒置15min，以防止DNBS溶液逸出。对照组在同一环境下用0.9%生理盐水。造模完成后，每天对动物称重，并评估肛门或粪便中是否存在腹泻和血液，计算疾病活动指数（dia activity index，DAI）［19］。模型组DAI若为对照组的2倍以上，视为造模成功。
1.2.2给药和样品采集40只Wistar大鼠随机分为5组（n=8），对照组、模型组（DNBS）和模型加药组（DNBS+Eto）3个剂量组：1.5mg/kg（低剂量）、3mg/kg（中剂量）、6mg/kg（高剂量）。除对照组外，其他4组按1.2.1方法造模后自由饮食饲养，第3天根据DAI判断所有大鼠造模成功。造模成功后按药物剂量每天腹腔注射给药1次，连续2周。实验结束后，10%氯胺酮麻醉，腹主动脉取血，分离血清，−20℃保存；结肠组织样本一部分保存于−80℃，一部分保存于37%~40%甲醛水溶液中。
1.2.3结肠黏膜损伤指数（colonic mucosal damage index，CMDI）的观测将大鼠处死后，取出结肠段，清除脂肪和肠系膜，在纵向打开后，评估结肠黏膜损伤指数，评分范围为：0，正常结肠（无损伤）；1，轻度充血，无溃疡；2，有闪点的溃疡或小的炎症区，充血水肿；3，大的炎症区和<1cm的溃疡；4，大面积组织损伤和>1cm的延伸。
1.2.4结肠组织学观察及评分（histopathological score，HS）取大鼠结肠病变最明显的一段，将其浸入10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察结肠组织学变化并评分。HS评分标准为：0，大鼠结肠黏膜无水肿、溃疡；1，肠黏膜轻度
水肿和炎症溃疡，病变在黏膜层；2，肠黏膜中度水肿和炎症溃疡，病变到达肌层；3，肠黏膜重度水肿和炎症溃疡，病变迁延至浆膜层。
1.2.5TUNEL凋亡染色将石蜡包埋的切片在二甲苯中脱蜡，在分级乙醇系列中脱水，用0.1mol/L 柠檬
酸缓冲液将石蜡包埋，然后在TUNEL反应混合物中37℃避光孵育1h。用PBS冲洗3次，每次
5min，在荧光显微镜下观察。
1.2.6Western blot取1.2.2保存的大鼠结肠组织，提取总蛋白，用Nanodrop2000测量蛋白质浓度并调平后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后，将膜用含有5％脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭2h。然后，将膜与抗Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、ACTIN（1∶1000）、p-P65和P65（1∶1000）4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，并与HRP标记的二抗室温孵育2h。使用增强的化学发光剂ECL及Quantity One软件分析蛋白条带的灰度值。
1.2.7氧化应激指标检测取1.2.2收集的大鼠血清，利用SOD和MDA试剂盒按照说明书对大鼠血清SOD、MDA水平进行检测。
1.2.8ELISA实验取1.2.2收集的大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书进行检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。
1.3统计学分析数据以xˉ±s表示，使用SPSS19.0软件统计数据，采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多程检验对各组数据进行统计分析，以P< 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1Eto可改善DNBS诱导的UC大鼠的体质量
如图1所示，模型组（DNBS组）DAI指数均值为2.05，远高于对照组DAI指数0.07的2倍（P< 0.05），模型构建成功。与模型组（DNBS组）相比，DNBS+Eto中、高剂量组随药物剂量增加DAI指数显著下降（P<0.05），低剂量组DAI指数无明显变化。
2.2Eto可减轻UC大鼠结肠组织的病变程度如图2所示，对照组大鼠结肠未观察到组织学改变，模型组结肠黏膜下层出现跨壁坏死、肠隐窝萎缩、水肿糜烂和明显的白细胞浸润，CMDI指数和HS评分明显高于正常组（P<0.05），与模型组相比，DNBS+ Eto中、高剂量给药组病变程度明显减轻，高剂量组结肠组织形态基本恢复正常，CMDI和HS评分呈剂量依赖性显著降低（P<0.05），低剂量组差异无统计学意义。2.3Eto可抑制UC大鼠结肠组织细胞凋亡如图3所示，与对照组相比，模型组细胞凋亡率和Bax/
Bcl-2显著上调（P<0.05），与模型组相比，
DNBS+Eto
图2肉眼和镜下观察结肠组织病理状态
Fig.2Pathological state of colon tissue was obrved by naked eye and microscope
Note：A.HE staining（×200）；B.Obrvation of colonic mucosal injury index；C.Histological obrvation and score of colon.Compared with the control group，*.P<0.05；compared with the model（DNBS）group，#.P<0.
05.
图1大鼠DAI评分
Fig.1Rat DAI score
Note：Compared with the control group，*.P<0.05；compared with the model（DNBS）group，#.P<0.
05.
图3结肠组织细胞凋亡检测
Fig.3Detection of apoptosis in colon tissue Note：A.TUNEL staining of apoptosis（×400）；B.Statistical results of cell apoptosis rate；C.Western blot was ud to detect Bax and Bcl-2protein expressions.Compared with the control group，*.P<
0.05；compared with the model（DNBS）group，#.P<0.05.
中、高剂量组随剂量增加，细胞凋亡率和Bax /Bcl -2显著下调（P <0.05），低剂量组差异无统计学意义。2.4Eto 可减轻UC 大鼠结肠组织的氧化应激损伤
如图4所示，与对照组相比，模型组SOD 水平明
显降低（P <0.05），MDA 水平明显升高（P <0.05）。与模型组相比，Eto 中、高剂量组SOD 水平随药物剂量增加而升高，MDA 水平随药物剂量增加而降低（P <0.05），Eto 低剂量组SOD 及MDA 水平无明显变化。2.5
Eto 可减弱UC 大鼠结肠组织的炎症反应
如
图5所示，模型组中IL -1β、IL -6和TNF -α水平及p -P65表达均显著高于对照组（P <0.05）。与模型组相比，Eto 中、高剂量组IL -1β、IL -6和TNF -α水平及p -
P65表达呈剂量依赖性显著下调（P <0.05），Eto 低剂量组差异无统计学意义。
3讨论
如今，UC 的治疗方法不断发展，但可用疗法仅
限于减轻症状和非特异性免疫调节剂［20］。因此，UC 的治疗仍然是具有重大医疗需求的领域。ZHANG 等［21］研究发现Eto 可通过降低脓毒症大鼠糖皮质激
素的表达来抑制NF -κB 激活，表明Eto 具有抗炎功效。本研究利用DNBS 诱导的UC 大鼠体质量显著下降，DAI 指数、CMDI 指数、HS 评分明显升高，黏膜下层出现跨壁坏死、水肿糜烂和明显的炎症细胞浸润，与文献报道一致，提示造模成功［22］。给予Eto 3mg /kg 、6mg /kg 处理后，随药物剂量增加，UC 大鼠体质量呈现显著改善，DAI 指数、CMDI 指数、HS 评分明显下降，且病变程度明显减轻。因此，Eto 对DNBS 诱导的大鼠UC 具有明显的治疗作用。
Bcl -2蛋白家族在细胞凋亡过程中起到关键的
调控作用，其中Bcl -2功能是抑制细胞凋亡，Bax 功
清水社区能是促进细胞凋亡。研究发现，Bax /Bcl -2决定了细胞凋亡与否［23］。本研究中DNBS 诱导的UC 大鼠细胞凋亡率和Bax /Bcl -2均显著上调，与模型组相比，Eto 中、高剂量组细胞凋亡率和Bax /Bcl -2均显著下调。因此，Eto 可抑制大鼠UC 诱导的细胞凋亡。
氧化应激是由自由基或过氧化物增加所引起的一种机体反应。自由基产生的增加对膜磷脂产生细胞毒性作用，导致形成有毒产物，如MDA 广泛用于评估氧化应激［10］。而SOD 具有减少脂质过氧化和清除自由基的作用［24］。本研究中Eto 中、高剂量组中SOD 含量较模型组显著增加，MDA 含量显著降低，提示Eto 通过抑制氧化应激保护UC 大鼠结肠组织。
UC 的一个主要特征是高水平的促炎症介质，如
细胞因子（TNF -α、IL -1β和IL -6），进而导致慢性炎症、溃疡和结肠黏膜损伤、白细胞浸润［25］。TNF -α有助于上皮屏障的破坏，诱导上皮细胞的凋亡，IL -6参与中性粒细胞的募集和激活，加剧炎症性肠炎的炎症状态，IL -1β和IL -6过量产生可能导致肠道炎症加重和肠道运动障碍［20］。本研究中Eto 中、高剂量组可显著降低DNBS 诱导的UC 大鼠血清中IL -1β，IL -6和TNF -α细胞因子的高表达，因此Eto 可通过抗炎保护UC 大鼠的结肠组织。NF -κB 作为一条经典的炎症信号通路，对诱发炎症有重要作用［26］。本研究发现UC 大鼠中p -P65表达水平相较于对照组显著上调，与模型组
相比，Eto 中、高剂量组中p -P65表达水平显著下调。因此UC 大鼠确实通过NF -κB 诱导促炎细胞因子的产生来增强炎症反应，而Eto
通过
图5ELISA 检测炎症因子水平及Western blot 检测NF -κB 磷酸化
Fig.5
Levels of inflammatory factors detected by ELISA and phosphorylation of NF -κB detected by West⁃ern blot
Note ：A~C.ELISA was ud to detect levels of IL -1β，IL -6and TNF -α
in rum of rats ；D.Western blot was ud to detect expression of NF -κB p -P65protein.Compared with the control group ，*.P <0.05；
compared with the model group ，#.P <0.
05.
图4氧化指标检测
酱香田螺Fig.4
Detection of oxidation indexes
Note ：A.SOD level detection ；B.MDA level detection.Compared with
the control group ，*.P <0.05；compared with the model （DNBS ）
group ，#.P <0.05.
下调NF-κB来抑制炎症的早期阶段和多个促炎基因的上调，从而减轻DNBS诱导的结肠炎。
Eto可通过增加GABA能受体活性来抑制神经元兴奋性，防止炎症和应激反应的发生［27］。GABA 受体已被证实在免疫细胞上存在，可降低外周巨噬细胞炎症因子的产生［28］。研究表明GABA能够抑制过度自噬，有效增强肠道黏膜屏障功能，对实验性结肠炎具有治疗作用［29］。因此Eto对DNBS诱导的UC大鼠保护机制可能是通过激活GABA能受体活性介导的，下一步可通过非Eto类GABA能激动剂
进一步证实。总之，本研究表明Eto对DNBS诱导的大鼠UC有一定的保护作用，其机制可通过减少细胞凋亡，抑制氧化应激反应，抑制NF-κB通路的激活来减少TNF-α等炎症因子释放，从而减轻UC炎症损伤，保护并促进结肠组织功能恢复。因此，本研究为临床上使用Eto治疗UC提供了更充分的实验依据。
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