第35卷第1期2021年2月南华大学学报(自然科学版)
Journal of University of South China(Science and Technology)
Vol.35No.1Feb.2021
收稿日期:2020-10-12
基金项目：国家自然科学基金项目(41402002)；全国大学生创新训练项目(S202010555043)
作者简介：陈㊀亮(1980 )，男，副教授，博士，主要从事水环境监测与评价等方面的研究㊂E-mail:715342131@qq.
如何租房com㊂∗通信作者：唐振平(1962 )，男，研究员，博士，主要从事矿山生态环境监测与评价方面的研究㊂E-mail:120007233200@
DOI :10.ki.1673-0062.2021.01.001韩剧古装剧
重金属联合毒性对蚤类与鱼类敏感性的影响及
预测模型研究进展
陈㊀亮1,2,3，章文波1，霍㊀正1，李陈浩1，周霞飞1，赵文惠1，唐振平1,2,3∗
全家福作文
(1.南华大学资源环境与安全工程学院，湖南衡阳421001;2.衡阳市核燃料循环地质理论与技术重点实验室,
湖南衡阳421001;3.稀有金属矿产开发与废物地质处置技术湖南省重点实验室，湖南衡阳421001)
摘㊀要：通过阅读文献了解各类重金属在联合作用情况下对水生生物产生的毒性效应并讨论了联合毒性的作用机制㊂研究了水环境中重金属污染对水生生物的敏感性影响，介绍了联合毒性作用的具体表现形式，总结了包括蚤类㊁鱼类等常见水生生物的收集与培养㊁联合毒性实验的具体步骤与结果讨论，对联合毒性的两种基本模型原理与预测结果进行了阐述㊂结果表明，水生生物存活率与重金属污染程度有着直接关系，重金属在联合作用时能够表现出不同的毒性影响㊂关键词：重金属；敏感性；联合毒性；预测模型中图分类号:X832文献标志码:A
文章编号:1673-0062(2021)01-0001-09
目标管理理论
Advances in Studies on the Effects of Combined Toxicity of Heavy Metals
on Flea and Fish Sensitivity and Predictive Models
CHEN Liang 1,2,3,ZHANG Wenbo 1,HUO Zheng 1,LI Chenhao 1,
ZHOU Xiafei 1,ZHAO Wenhui 1,TANG Zhenping 1,2,3∗
(1.School of Resource Environment and Safety Engineering,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Hengyang Key laboratory of Geological Theory and Technology for the
Nuclear Fuel Cycle,Hengyang,Hunan 421001,China;3.Hunan Key Laboratory of Rare Metal Minerals Exploitation and Geological Disposal of Wastes,Hengyang,Hunan 421001,China)Abstract :It stated the toxic effects of various heavy metals on aquatic organisms under the combined action and discusd the mechanism of combined toxicity through reviewing liter-ature.This article studies the toxic effects of heavy metal pollution in the aquatic environ-
㊀㊀㊀南华大学学报(自然科学版)2021年2月ment on aquatic organisms,introduces the manifestations of the combined toxic effects of heavy metals.In addition,it summarizes the specific steps and discussion of the collection and cultivation of common aquatic organisms including cladoceran,fish,and joint toxicity experiments,and explains the principles and prediction results of two basic models of joint toxicity.In general,the survival rate of aquatic organisms is directly related to the degree
of heavy metal pollution,and heavy metals can exhibit different toxicity when combined.
key words:heavy metals;nsitivity;joint toxicity;prediction model
0㊀引㊀言
20世纪以来，科学技术得到迅猛发展，在经济与人民生活水平高速提高的过程中，地球环境质量却迅速下降，人类也付出了惨重的代价㊂重金属作为典型的污染物，可导致环境质量急剧恶化，在食物链作用下最终危害人体健康，其污染主要来源于工业方面，特别在矿山开发㊁废气排放等过程中会对周围的河流㊁湖泊环境产生严重影响[1-4]㊂近年来，世界上针对重金属污染物的联合毒性研究越来越多㊂蚤类与鱼类作为水生生物重要组成部分，被研究者广泛用于监测水环境污染状况,E.Perez[5]使用大型蚤评价了Cd与Zn的联合毒性,D.B.Kim[6]采用两种蚤类对废弃金属矿山的地表水和土壤生态毒性进行了评价，李建[7]使用15种常见鱼类监测长江上游水体的重金属危害,Z.Torres[8]将湖泊中重金属污染程度与鱼类数量联系在一起评判其对湖泊环境的影响㊂为此，本文归纳与总结国内外重金属对蚤类[9-14]与鱼类[15-20]的联合毒性实验研究以及相关联合毒性预测模型，并指出目前存在的问题与未来发展趋势㊂
1㊀联合毒性作用的表现形式1939年C.I.Bliss[21]提出研究两种毒物联合作用的毒性并首次提出了协同作用，拮抗作用，加和作用的划分㊂多种重金属共存于同一环境中，相互作用机理非常复杂，研究结
果常出现差异[22]㊂重金属复合污染的效应随重金属元素性质及浓度组合的不同而发生改变㊂
1.1㊀协同作用
协同作用是指多种污染物共存时所产生的毒性效应大于各污染物单独作用的毒性效应之和，即某污染物的毒性被其他污染物强化，进而增大了其整体毒性㊂重金属复合污染协同效应对环境具有较大威胁，这使得研究协同效应对评价环境安全以及制定相关环境保护政策具有重要意义㊂协同作用分单向效应和双向效应，单向效应是指一方促进，另一方被抑制，双向效应则两者均促进或均抑制㊂
1.2㊀拮抗作用
拮抗作用是指多种污染物共存所产生的毒性效应小于各污染物单独作用的毒性效应之和，毒性效应被2种或2种以上污染物的交互作用降低㊂从某种程度上可将位点竞争视作复合污染产生拮抗作用的直接原因㊂这些位点包括细胞表面及代谢系统的活性部位和生态介质中的吸附位点，如金属硫蛋白，特定组织器官上的结合位点，植物根和土壤中的吸附位点等㊂
1.3㊀加和作用
加和作用是指多种污染物共存时所产生的毒性效应等于各污染物单独作用的毒性效应之和㊂目前有关重金属复合污染表现为加和作用的报道较少，大多数表现为协同与拮抗作用㊂复合污染的加和效应通
常有两种形式，即浓度加和与效应加和㊂
总之，重金属复合污染与各种重金属在环境中的浓度及其组合关系㊁生物的种类㊁部位和暴露方式等因素密切相关，表现得极为复杂，不仅仅是单纯的协同㊁拮抗或加和作用㊂重金属复合污染的机理也不可能是简单的各重金属元素单独毒害的机理，许多水化学参数㊁生物年龄等因素均可改变重金属联合毒性的影响[23-25]㊂
2㊀重金属联合毒性实验
2.1㊀收集与培养
关于水生生物的收集一般分为两种方式，第一种为野外实验标本采集，第二种为专业饲养中心购买㊂首先，第一种野外实验标本采集通常为研究者在野外通过手抄网等在河流或湖泊中抓捕部分样品，再罐装或盒装带回实验室进一步筛选目标样品㊂第二种则是在专业饲养中心购买，然后在实验室中按照标准生活环境进行饲养㊂由于
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第35卷第1期陈㊀亮等：重金属联合毒性对蚤类与鱼类敏感性的影响及预测模型研究进展
目前国内关于实验用水生生物的饲养已成熟，所以类似大型蚤㊁斑马鱼的收集通常采用第二种购买的方式㊂如大型蚤的培养通常置于人工恒温培养箱中，采用大口径玻璃烧杯，烧杯里装有曝气达到48h以上的自来水，保持一定的pH值㊁硬度㊁碱度以及溶解氧，设定好适宜的环境温度与光暗周期，放置一定数量的大型蚤，以满足其对空间的需求，每周定时定量进行培养水的更换以及食物喂养，食物喂养可以选择合适的藻类或鱼食㊂
2.2㊀实验方案
梦到仇人
重金属联合毒性实验主要为三个部分组成: 1)预实验，根据预实验结果获得无致死浓度与最大致死浓度㊂2)正式实验，包括单一重金属毒性实验与联合重金属毒性实验，联合毒性实验的实验方案可分为四类:(1)常见的实验设计是简单地改变金属的绝对浓度，同时保持一个恒定的金属比例(如保持ρ(Cu)ʒρ(Zn)=1ʒ10)㊂(2)保持恒定的效应比(如Cu LC25+Zn LC25)㊂(3)系统地改变金属的效应比，使之产生一个恒定的总效应水平(如Cu LC25+Zn LC75,Cu LC50+Zn LC50，产生的总名义效应水平为100%的死亡率)㊂(4)可采用类似于化学滴定的设计，即在含有一种或多种其他试剂的溶液中依次增加一种试剂的量，以确定中间反应和滴定终点㊂3)实验结果讨论，根据单一重金属的毒性与联合重金属的毒性结果比较，分析联合作用效应与联合作用机制㊂
2.3㊀重金属联合毒性具体实验
2.3.1㊀重金属联合毒性对大型蚤的作用
蚤类作为常见的水生生物，首先其位于食物链的底端，研究重金属对蚤类的影响可引申出重金属对人类身体健康的影响程度，其次蚤类能成为研究环境污染的重要指标，也与其对环境质量的敏感性有关，因此蚤类被广泛运用于毒理学和生态风险评估㊂其中大型蚤是一种小型的蜉蝣甲壳类动物，长度大约为0.2~5mm，在河流㊁湖泊中广泛分布㊂由于其较短的生活周期和良好的繁殖能力，在国际上被公认为标准受试生物㊂国外对大型蚤的毒理学研究已非常成熟,1972年美国环保局就制定了大型蚤的毒性试验标准方法[26], 1982年E.N.Attar[27]等研究了大型蚤暴露于Zn 和Cd中的单一及联合毒性效应，获得该生物暴露于Zn和Cd中36㊁48㊁60㊁72和96h的剂量-死亡率曲线㊂2006年J.R.Shaw[28]等结合了四种蚤类进行了48h急性毒性实验，逐个呈现Zn和Cd 的影响，以确定致死效应浓度并用于推导一系列金属组合所产生的混合效应㊂J.S.Meyer[29]等以大型蚤为实验对象，将其暴露于Cd㊁Cu和Zn的二元或三元混合物中进行急性试验，在单一毒性实验中发现Cd㊁Cu和Zn的半数抑制浓度EC50值分别为13.5μg/L㊁103μg/L与696μg/L，其属毒性降序为Cd>Cu>Zn㊂联合毒性实验中发现联合作用产生的毒性与其产生毒性的机制具有很强关联性㊂Cu-Zn急性毒性的主导过程为金属与金属在暴露水中结合溶解有机物(dissolved organic
matter,DOM)的竞争，竞争将导致暴露水中Cu2+或Zn2+浓度增加，这造成生物可利用Cu㊁Zn浓度升高，毒性增强表现为协同作用㊂Cd-Cu㊁Cd-Zn 在一定程度均表现了一定的拮抗作用，这是因为其毒
性的主导过程为金属与金属结合生物配体(bio-ligand,BL)的竞争㊂只要Cu保持在亚致死浓度,Cd导致的死亡率就会下降，因为毒性更强的Cd越来越被毒性较小的Cu阻止与BL结合，从而总体的毒性降低表现为拮抗作用㊂但是当Cu达到单一Cu的半数抑制浓度EC50时，死亡率开始增加，因为此时Cu也开始产生致死的毒性，导致总体的毒性增加表现为协同作用㊂Cd-Zn产生的毒性也是同样的主导过程，结果与Cd-Cu一致㊂E.M.Traudt[30]等研究了Ni㊁Cd㊁Cu㊁Zn对大型蚤的单一与二元联合的急性毒性㊂其方法为通过一种金属的浓度保持不变，而另一种金属的浓度通过一系列从非致死浓度到致死浓度不等的变化，然后观察毒性状况㊂根据个别金属毒性试验的半数抑制浓度EC50值,Ni的毒性最小，其次是Zn㊁Cu和Cd，毒性依次递增㊂在联合毒性实验中,Ni-Cd二元混合作用，当Cd的浓度保持不变, Ni浓度增加，产生抑制现象，甚至在某些情况下完全消除初始Cd的毒性㊂例如0.1mg/L初始情况下,Ni质量浓度很低几乎没有，此时的死亡率接近于100%，毒性只有Cd引起，随着Ni质量浓度的增加，在大约0.5mg/L时，死亡率逐渐下降到5%的最低水平，说明Ni对Cd毒性有很大的保护作用㊂然而，当Ni浓度高到足以引起Ni诱导的毒性时，死亡率增加，这些结果与Zn对大型蚤的Cd毒性保护作用类似㊂Cu和Ni的每一种二元混合物产生的毒性均表现为协同作用㊂此现象解释为金属之间结合DOM的竞争机制㊂Ni和Zn有相似的毒性，在Ni浓度随着Zn浓度的增加而保持不变的混合物中，混合物毒性均表现为拮抗作用㊂
国内关于大型蚤的研究也逐渐发展起来,
陶澍
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㊀㊀㊀南华大学学报(自然科学版)2021年2月
1991年我国制定了大型蚤急性毒性测定方法[31]，董晓晓等[32]以静水生物测试法研究了Cu㊁Cd和Se对大型蚤的单一及联合毒性效应，并采用水生毒理联合毒性相加指数法[33]对其联合毒性效应进行了评价㊂许永香等[34]探讨Se㊁Cd㊁Zn 共存时的毒性变化机理，结果表明，除了Cd和Zn 的毒性比1ʒ1和质量浓度比1ʒ1情况下表现为协同作用外，其余均为拮抗作用㊂这些可表明大型蚤以其对环境的良好敏感性成为了分析环境污染程度的重要指标㊂丁婵娟[35]以重金属Cu㊁Pb 和Zn为实验毒物，采用静水暴露方式，研究了其对大型蚤的单一与联合毒性㊂单一毒性实验结果表明不同毒物对大型蚤的的毒性强弱程度有所差异,Cu㊁Pb和Zn的24h半数致死浓度LC50分别为0.123mg/L㊁2.392mg/L和4.084mg/L,48h 半数致死浓度LC50分别为0.102mg/L㊁1.136 mg/L和2.732mg/L㊂由此判断，三种重金属毒性大小依次为:Cu>Pb>Zn㊂在联合毒性实验中，按照毒性比1ʒ1和质量浓度比1ʒ1两种不同浓度配比方式，进行两两以及三者联合实验㊂实验结果表明：无论是毒性比1ʒ1还是质量浓度比1ʒ1,Cu-Zn㊁Cu-Pb和Cu-Pb-Zn三者的联合毒性均表现为协同作用，而Pb-Zn的联合毒性均表现为拮抗作用㊂
2.3.2㊀重金属联合毒性对鱼的作用
目前人们对于许多化学物的单一毒性已有较多了解，但是对于人类环境中实际存在多种污染物的联合
毒性作用及其机理则认识的还不够深入㊂两种或多种化学物同时作用于生物体时，往往会引起与单一毒物作用完全不同的毒性反应㊂鱼类是河流㊁湖泊生态系统中的重要组成部分，通过对该生物毒性实验能够充分体现其生存环境的危害状况㊂例如斑马鱼因为和人类基因有着高度的相似性，其实验结果大多数情况下适用于人体，并且容易饲养，因此被广泛用于水质环境的检测㊂鱼类因其在水生生物中特殊的组成有着重要的研究价值，国外对于鱼类毒性实验的目标生物非常多,B.S.Khangarot[15]等以硬骨鱼为实验对象，研究了Ni㊁Zn与Cu的联合毒性，发现其各重金属48h半数致死浓度LC50,Zn为75mg/L㊁Ni 为37mg/L以及Cu为2.5mg/L㊂在Zn-Ni㊁Ni-Cu 与Zn-Ni-Cu三者的联合作用中，毒性表现为协同作用㊂单一重金属混合后对鱼类的毒理学危害更加严重㊂C.Mebane[16]等研究了包括鱼类以及无脊椎动物在Cd㊁Pb和Zn联合作用下的毒性状况㊂结果发现在Cd-Zn的情况下，无脊椎动物的最低EC50s至少比鱼类大一个数量级㊂鳟鱼对Pb 和Zn的毒性抗性随鱼体大小增加而下降㊂金属混合物的反应是复杂的，三种金属的毒性在浓度添加基础上均表现为拮抗作用㊂N.R.Lynch[17]等对鲦鱼进行了标准96h毒性试验，包括单一金属和二元金属混合物，以评价二元金属联合的毒性作用，实验终点为96h累积的死亡率㊂实验遵循固定浓度比例设计，分析金属混合物协同与拮抗作用㊂基于初步测试结果，单一金属实验浓度从0%至100%死亡率范围内选择，联合金属实验中Cu㊁Zn㊁Ni的金属质量浓度分别为25μg/L至
400μg/L㊁50μg/L至800μg/L㊁250μg/L至2000μg/L㊂每个金属浓度和对照各重复三次，每个重复试验
包含10条幼鱼㊂单一重金属情况下,Cu㊁Zn与Ni的96h半数致死浓度LC50值分别为125μg/L㊁821μg/L和3920μg/L，总体而言，其死亡率随着金属浓度的增加而增加㊂在相似的浓度下，由个别重金属引起的总死亡率低于由混合重金属引起的总死亡率㊂例如，在单独2A 浓度Cu和2B浓度Zn下，总死亡率为23%，其中20%归因于Cu,3%归因于Zn，但这一总死亡率低于二者混合后产生的60%死亡率㊂同样，对于Cu 和Ni，总死亡率由单独2A浓度Cu和2C浓度Ni 是21%，这低于其暴露在Cu+Ni混合物类似浓度的97%死亡率㊂同样情况也发生在Ni-Zn的混合毒性实验中㊂这些结果均揭示了二元金属混合物对鲦鱼的毒性为协同作用㊂
国内对于鱼类的重金属联合毒性实验研究也很多，王银秋等[36]以鲫鱼为受试生物，以致死率为指标研究了不同重金属Cd㊁Zn㊁Pb对鱼类的急性毒性㊂应用相加指数法进行Cd㊁Zn㊁Pb的联合毒性研究，其结果表明:Cd与Pb㊁Cd与Zn的联合毒性具有明显的协同作用，而Pb与Zn结果相反出现了较强的拮抗作用㊂赵岩等[37]采用静水生物测试法研究了Cu㊁Cd和Cr等重金属对孔雀鱼的单一与联合毒性效应㊂通过单一毒性试验结果得到其不同暴露时间的半数致死浓度LC50,3种重金属离子对孔雀鱼均为高毒性，毒性大小为Cu>Cd>Cr㊂通过联合毒性实验结果得到，当浓度相同时,Cu-Cd㊁Cu-Cr㊁Cd-Cr以及三者共存时的联合毒性均为毒性增强的协同作用㊂修瑞琴等[38]以斑马鱼为实验生物，按国际标准组织斑马鱼标准实验法进行了毒性实验，采用相加指数法对As㊁Cd与Zn的联合毒性进行了评价㊂在完成
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第35卷第1期陈㊀亮等：重金属联合毒性对蚤类与鱼类敏感性的影响及预测模型研究进展
As㊁Cd 与Zn 的单一毒性基础上，再进行As-Cd㊁As-Zn 与Cd-Zn 按毒性比1ʒ1及质量浓度比1ʒ1的不同配比下二元混合以及三元混合的联合毒性实验㊂最后通过单一毒性实验结果与联合毒性实验结果的LC 50值比较，分析联合作用下产生的毒性变化㊂结果表明,As-Cd㊁As-Zn 共存时联合毒性均为拮抗作用，说明此二者共存互相降低了毒性㊂而Cd-Zn 联合毒性结果中除了毒性比1ʒ1时，结果为拮抗作用外均为毒性剧增的协同作用,Cd 的存在增加了Zn 的毒性，二者共存时毒性远远大于单一毒性和㊂当3种毒物联合时其毒性为拮抗作用㊂
3㊀联合毒性作用的预测模型
许多理论模型已经发展并应用于预测化学混合物的行为[39-41]㊂最常见的模型为浓度加成模型(concentration addition model,CA)与独立作用模型(independent action model,IA)，二者被用于描述基于单一化学品作用方式的联合毒性㊂浓度加成模型(CA)假设化学品具有相同的作用方式㊂该模型以浓度为基础，对作用相似的化学品毒性进行求和，并按比例反映它们的相对毒性㊂另外，独立行动模型(IA)假设化学物质通过不同的作用方式影响生物体，因此它们的影响在统计上是相互独立的㊂
3.1㊀浓度加成模型(CA )3.1.1㊀模型介绍
CA 模型的理论原理[42]，不相互作用的化学
物质只在效力上不同，可以看作是彼此的稀释㊂由于同一种化学物质的不同稀释度始终符合CA，并将以相同的作用机制运作，因此通常假定不同化学物质的混合物在同样的分子靶点作用时也适用于CA 模型㊂为了计算使用CA 化学物质的联合作用效应，可通过将混合物中每种化学物质的浓度与其单一物质毒性联系起来计算稀释程度，将浓度相加，并计算剂量-反应曲线㊂
浓度加成的概念为假定化学品具有相同的毒性作用机制，计算公式(1)如下:
T U =EC x ,mix =
ð
n
i =1
p i EC x ,i
()
-安慕希酸奶
拔牙后饮食1
(1)
㊀㊀其中:p i 表示的是化合物中组分i 浓度占混合物浓度的比例,EC x ,i 是组分i 达到x 效应时的浓度,EC x ,mix 是多种组分达到x 效应时的浓度㊂当计算结果为1时，表明混合物之间的作用为加和作用；小于1时为协同作用；大于1时为拮抗作
用㊂这个方程式适用于作用相似化学品毒性总和的预测㊂
浓度增加通常被认为是对作用方式相似或作用于相同靶点的化学物质联合毒性的合理预期㊂但是仅仅对靶点和作用方式定义是不准确的，因为它们具有剂量依赖性，比如大多数化学品在低剂量下有一个靶点或作用方式，而在较高剂量下有其他靶点或作用方式㊂此外，许多化学品均不了解其靶点和作用方式㊂尽管浓度加成模型CA 对于已知有相似目标位点的混合物预测结果存在不确定性，但是已经证明其为一个精确的参考模型㊂
3.1.2㊀模型应用T.Schell [43]利用大型蚤的急性和慢性反应评
估了CA 模型对7种田间相关农药混合物的预测状况㊂当使用CA 模型预测作为参考时，农药混合物显示出很大程度的协同或拮抗作用㊂与急性的反应变量相比，慢性对CA 预测的偏差更低㊂此外，相对
于只含有少量农药的混合物,CA 对复杂混合物的预测通常更准确㊂研究表明,CA 模型在很大程度上可以保护农药混合物的风险评估，证明其作为默认模型的使用是合理的㊂M.Jung-hans [44]研究了作用机制相似的8种除草剂对藻类的复合毒性时，发现CA 模型的预测能力更强,
IA 模型低估了混合物的复合毒性㊂
C.Chen [45]采用CA 模型测定了五种杀虫剂
(A.Chlorpyrifos㊁B.Malathion㊁C.Tri-azophos㊁D.
Fenobucarb 和E.Carbosulfan)的四种二元混合物对鲤鱼脑内乙酰胆碱酯酶(acetylcholinestera,
AChE)活性抑制的毒性和联合作用类型㊂单一毒性实验下发现暴露96h 可导致鲤鱼的亚致死㊁浓度依赖性降低㊂未暴露和单独暴露于溶剂的鱼AChE 活性没有显著差异㊂AChE 的半数抑制浓度EC 50值，五种杀虫剂的毒性各不相同，依次为:
C>A>D>E >B㊂等剂量二元混合物实验中,A 与C㊁D 混合时，预测毒性对于观察的结果没有明显不同，表现为加和作用㊂相比之下,A 与E 的预测混合毒性明显小于观察值，表现为拮抗作用㊂而A 与B 混合时，预测毒性高于观察值，表现为协同作用㊂质量浓度比1ʒ1混合实验中,A 与C㊁E 混合时，预测毒性与观察毒性相似㊂A 与B㊁D 混合时，实际毒性高于预测的结果㊂预测结果显示CA 模型没有明显
低估任何测试混合物的毒性，因此适合用于生态风险评估㊂
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