土 壤(Soils), 2020, 52(5): 911–919
DOI: 10.ki.tr.2020.05.006
朱侠, 李连祯, 涂晨, 等. 不同性质农田土壤中铜的可提取性与生物有效性及毒性. 土壤, 2020, 52(5): 911–919.
不同性质农田土壤中铜的可提取性与生物有效性及毒性①
朱侠1, 2，李连祯1，涂晨1，骆永明2, 3*
(1 中国科学院海岸带环境过程与生态修复重点实验室(烟台海岸带研究所)，山东烟台 264003；2 中国科学院大学，北京 100049；3 中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室(南京土壤研究所)，南京 210008)
摘要：以重金属总量为基础的土壤环境质量标准已不适用于当前土壤管理的需求，基于重金属生物有效性的生态风险评估和环境阈值研究对土壤重金属环境质量标准的修订具有重要的指导意义。本研究选取黑土、潮褐土和脱潜水稻土3种不同性质的农田土壤，开展模拟铜(Cu)污染的生物毒性试验，采用HNO3、EDTA-Na2、NH4OAc和CaCl2 4种不同浸提能力的化学试剂进行土壤有效态Cu 提取，探讨Cu可提取性与生物有效性及毒性的关系；并通过敏感性生态物种生菜和赤子爱胜蚓的Cu暴露试验，推导基
于化学提取有效态的土壤Cu生态毒性阈值。研究结果表明：HNO3(41.4%)和EDTA-Na2(56.8%)对3种土壤中Cu的平均提取效率显著高于NH4OAc(0.12%)和CaCl2(8.70%)。CaCl2提取态Cu含量与生菜Cu富集量和毒性效应之间存在显著或极显著相关，HNO3提取态Cu 含量则能很好地指示蚯蚓Cu富集量和30 d死亡率。不同生态受体毒性终点对土壤可提取态Cu的敏感性存在差异，选用物种最敏感指标推导3种土壤中Cu的有效态毒性阈值EC20和EC50，结果显示，基于不同化学提取态Cu含量的生菜毒性阈值EC20范围分别是90.5 ~ 170 mg/kg(HNO3)、103 ~ 195 mg/kg(EDTA-Na2)、3.97 ~ 20.1 mg/kg(NH4OAc)和0.21 ~ 8.68 mg/kg(CaCl2)，EC50范围分别是110 ~ 188 mg/kg(HNO3)、119 ~ 230 mg/kg(EDTA-Na2)、5.69 ~ 32.2 mg/kg(NH4OAc)和0.26 ~ 9.62 mg/kg(CaCl2)；基于不同化学提取态Cu含量的赤子爱胜蚓死亡率毒性阈值EC20范围分别是138 ~ 193 mg/kg(HNO3)、108 ~ 226 mg/kg(EDTA-Na2)、8.92 ~ 11.6 mg/kg(NH4OAc)和0.36 ~ 10.6 mg/kg(CaCl2)，EC50范围分别是183 ~ 221 mg/kg(HNO3)、180 ~ 331 mg/kg(EDTA-Na2)、13.1 ~ 18.3 mg/kg(NH4OAc)和0.54 ~ 13.2 mg/kg(CaCl2)。研究结果可为我国农田土壤重金属有效态化学提取方法的比选与优化提供科学依据，同时对基于生物有效性的土壤重金属环境质量基准与标准的研究和制定具有重要意义。
关键词：土壤；铜；可提取性；生物有效性；生物毒性；阈值
中图分类号：X825 文献标志码：A
Extractability, Bioavailability and Toxicity of Cu in Farmland Soils with Different Properties ZHU Xia1,2,LI Lianzhen1, TU Chen1,LUO Yongming2,3*
(1 Key Laboratory of Coastal Environmental Process and Ecological Remediation, Yantai Institute of Coastal Zone Rearch, Chine Academy of Sciences, Yantai, Shandong 264003, China; 2 University of Chine Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chine Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)
Abstract:The environmental quality standards bad on total contents of heavy metals can’t meet the requirements of current soil management, studies on risk asssment and toxicity threshold that considering the bioavailability of heavy metals have great significance for the revision of corresponding standards. In this study, three farmland soils with different properties, i.e, black soil, meadow cinnamon soil, unsubmerged paddy soil, were lected and biological toxicity tests were conducted by simulating Cu pollution, four chemical extractants with different extraction capacities, including HNO3, EDTA-Na2, NH4OAc and CaCl2, were ud to extract bioavailable Cu, the relationship between Cu extractability, bioavailability and toxicity were analyzed, and the toxicity thresholds of Cu were deduced for lettuce and earthworm Einia foetida. The results showed that H
NO3 (41.4%) and EDTA-Na2 (56.8%) had strong Cu extraction ability, but NH4OAc (0.12%) and CaCl2 (8.70%) had weak ability. Cu extracted by CaCl2 significantly correlated with Cu accumulated in lettuce, the toxic effect, and the acute mortality of earthworms, while Cu
①基金项目：国家重点研发计划项目(2016YFD0800405、2016YFE0106400)和中国科学院STS项目(KFJ-STS-ZDTP-005)资助。
* 通讯作者(************)
作者简介：朱侠(1993—)，女，山东临沂人，硕士研究生，主要研究方向为土壤重金属的生物有效性与基准。E-mail：***********
912 土壤第52卷
extracted by HNO3 significantly correlated with the chronic toxicity and Cu accumulated in earthworms. Bad on the effective concentration of different extractable Cu, the deduced EC20 for lettuce ranged from 90.5 mg/kg to 170 mg/kg bad on HNO3, 103 mg/kg to 195 mg/kg bad on EDTA-Na2, 3.97 mg/kg to 20.1 mg/kg bad on NH4OAc and 0.21 mg/kg to 8.68 mg/kg bad on CaCl2, while the deduced EC20 for earthworm Einia foetida ranged from 138 mg/kg to 193 mg/kg
bad on HNO3, 108 mg/kg to 226 mg/kg bad on EDTA-Na2, 8.92 mg/kg to 11.6 mg/kg bad on NH4OAc and 0.36 mg/kg to 10.6 mg/kg bad on CaCl2. The deduced EC50 for lettuce ranged from 110 mg/kg to 188 mg/kg bad on HNO3, 119 mg/kg to 230 mg/kg bad on EDTA-Na2, 5.69 mg/kg to 32.2 mg/kg bad on NH4OAc and 0.26 mg/kg to 9.62 mg/kg bad on CaCl2, while the deduced EC50 for earthworm Einia foetida ranged from 183 mg/kg to 221 mg/kg bad on HNO3, 180 mg/kg to 331 mg/kg bad on EDTA-Na2, 13.1 mg/kg to 18.3 mg/kg bad on NH4OAc and 0.54 mg/kg to 13.2 mg/kg bad on CaCl2. The results have great significance for the lection and optimization of effective extraction methods of heavy metals in soils and the revision of environmental quality standards bad on heavy metals bioavailability.
Key words: Soil; Cu; Extractability; Bioavailability; Toxicity; Threshold
我国土壤重金属污染问题不容忽视[1]。土壤中重金属的总量可在一定程度上反映其污染程度，但仅有部分形态的重金属可溶解到土壤溶液中，并通过溶液对生态系统产生危害[2]。重金属的毒性和生物可利用性更大程度上取决于其生物有效态，以总量评价土壤重金属的污染程度往往会高估其污染水平。在研究中常用化学提取剂对重金属生物有效性进行表征，不同提取剂对不同类型土壤重金属的提取效果不同[3-6]，有机质、pH、黏粒含量等因子通过影响重金属在土壤中的分布与形态，进而影响其有效性和毒性[7-8]。考虑到土壤理化性质对重金属生物有效性的影响，许多国家和地区基于土壤理化性质
的差异分区域建立了重金属环境质量标准，但我国土壤重金属环境标准制定仍以总量为限值，难以准确反映重金属对生物的毒害效应[9-10]。因此，筛选适合的有效态提取剂，探索以有效态为基础的土壤重金属生态毒性阈值，对研究制定基于生物有效性的土壤环境质量基准及标准具有重要意义[11]。
铜(Cu)是农田土壤的主要重金属污染物之一，Cu 过量会对土壤中动植物的生理生化功能产生毒害作用[12-14]。Cu通常以Cu2+ 形态进入土壤，以可溶性有机物的形态存在于土壤孔隙水中，易络合在铁铝氧化物表面，或吸附于黏土矿物，其形态和生物有效性受土壤理化性质影响显著[7-8]。本研究以Cu为例，选取我国3种代表性的农田土壤，通过HNO3、EDTA-Na2、NH4OAc和CaCl2 4种化学提取剂对模拟Cu污染土壤的有效态Cu进行分析，以敏感生态物种生菜和赤子爱胜蚓为受试生物进行毒性暴露试验，研究基于化学提取有效态Cu含量的生态毒性响应，推导基于有效态的土壤Cu生态毒性阈值，以期为我国农田土壤重金属有效态化学提取方法的比选、优化和基于生物有效性的土壤重金属环境质量标准的制定提供方法和思路。
1 材料与方法
公司的英文
lol啥意思1.1 供试土壤
供试的3种农田土壤分别采自黑龙江海伦(47°25´N，126°47´E)、河北保定(38°31´N，115°25´E)和浙江嘉兴(30°51´N，120°41´E)。采集0 ~ 20 cm表层土壤，自然风干，过10目筛和100目尼龙筛后，装自
封袋保存和测定。3种土壤的理化性质及重金属全量见表1。
根据土壤pH的不同，添加不同量的CuSO4·5H2O 制成不同Cu含量污染土壤，具体添加量为：pH<6.5 土壤，Cu添加量分别为0、100、200、400、800、1 000 mg/kg；pH>6.5土壤，Cu添加量分别为0、200、400、800、1 600、2 000 mg/kg。所有土壤样品制备5 kg，保持田间最大持水量的70%，充分混合均匀后，室温培养30 d，老化后的土壤经自然风干后，过10目尼龙筛备用。
1.2 土壤重金属有效态测定
称取过10目尼龙筛的风干土壤样品1.000 0 g(± 0.000 5 g)于50 ml塑料离心管中，分别加入10 ml 不同的提取剂，置于振荡箱中按照表2所述条件进行恒温振荡后，1 000 g离心10 min，取上清液过0.45 μm 滤膜后，用ICP-MS(电感耦合等离子体质谱仪，ELAN DRC II，PerkinElmer)测上清液中提取态Cu的含量。每组重复3次。
1.3 植物毒性试验
以生菜作为受试生物，选取生菜的根长、株高和生物量作为生菜的毒性效应指标，检测不同农田土壤中Cu的植物毒害。农田土壤Cu的植物毒害试验参
第5期 朱侠等：不同性质农田土壤中铜的可提取性与生物有效性及毒性 913
表1 供试土壤的理化性质
项目进度安排
Table 1 Physiochemical properties of tested soils
重金属全量 (mg/kg)
采集地点 土壤类型 pH
有机质(g/kg)
黏粒(%)CEC(cmol/kg)Cd Cu Zn Ni Pb
黑龙江海伦 黑土 5.78 54.7 32.8 33.4 0.26 19.1 60.2 25.9 21.8 河北保定 潮褐土 8.21 7.90 14.4 9.50 0.28 19.7 52.9 24.1 19.0 浙江嘉兴
脱潜水稻土
6.82 33.4 26.2 20.4 0.25 30.3 80.5 34.4 31.4
表2 不同化学提取剂的提取条件
Table 2 Extraction conditions of different chemical extractants
提取剂
pH
固液比
提取温度(℃)
振荡频率(r/min)
提取时间(h)
0.43 mol/L HNO 3 0.50 1∶10 20 ± 2 25 ± 10 4 0.05 mol/L EDTA-Na 2 8.00 1∶10 25 ± 2 180 ± 20 2 1 mol/L NH 4OAc 7.00 1∶10 25 ± 2 180 ± 20 1 0.1 mol/L CaCl 2 7.00
1∶10 25 ± 2
180 ± 20
2
考ISO 的标准方法[15-16]进行。称取200 g 风干土壤于塑料盆中，加去离子水至田间最大持水量的70%，并平衡24 h ；选择饱满、均一的生菜种子，用1% NaClO 溶液浸泡15 ~ 20 min ，消毒灭菌后用去离子水洗净，放入装有2 层湿润滤纸的培养皿中，在25℃培养箱里催芽24 h ；选择发芽的种子移栽在事先平衡好的盆栽土壤中，每盆移栽9棵，在人工气候培养室中(25)℃中生长60 d ，利用称重法保持整个过程中土壤水分含量为田间最大持水量的70%；60 d 后小心采集整株植株，避免采集过程中植物根系的损伤，用去离子水冲洗干净，并测量生菜株高、根长和生物量。
生菜可食部位累积Cu 含量测定采用HNO 3消解法进行，具体操作为：将生菜根系移除后，取生菜地上部放在 –80℃冰箱中冷冻12 h 后，在冷冻干燥器冻干至恒重；称量干重后，将生菜置于玻璃消解瓶中，加入5 ml 浓HNO 3消煮至近干(若消解不彻底，继续加5 ml 浓HNO 3)，用去离子水定容至10 ml ，作为待测液。过0.45 μm 滤膜后，用ICP-MS 测定植株地上可食部位Cu 含量。
1.4 蚯蚓毒性试验
农田土壤Cu 的蚯蚓毒性试验参考ISO 的标准方法[17]进行。称取500 g 风干土壤于有孔带盖塑料盒中，每个处理重复3次，加去离子水至田间最大持水量的70%，平衡24 h 。将赤子爱胜蚓置于装有2 层湿润滤纸的培养皿中，在25℃培养箱里清肠24 h 后，选择活性状态良好、大小均一的赤子爱胜蚓清洗称重后转移至塑料盒中，每盒放置8条。蚯蚓在人工气候培养室中(25)℃中培养30 d ，利用称重法
保持整个过程中土壤水分含量为田间最大持水量的70%。在培养14 d 和30 d 时，轻轻翻动土壤，将盒内蚯蚓取出，
作业的英语单词记录其死亡。30 d 后用去离子水将蚯蚓冲洗干净，置于装有2 层湿润滤纸的培养皿中，在25℃培养箱里清肠48 h 后，清洗称重后于–80 ℃冰箱中冷冻12 h 后，在冷冻干燥器中冻干至恒重，用浓硝酸消煮，定容至10 ml ，用ICP-MS 测定蚯蚓体内Cu 含量。
1.5 数据处理
土壤中重金属含量和毒性效应关系曲线并无特定的拟合方法，常用的剂量–效应拟合曲线有Log- normal 、Log-logistic 和Weibull 等，其中Log- logistic 函数因结果更具有实际性而被广泛应用[18]。本研究选择Log-logistic 函数对土壤中不同提取态Cu 含量与生菜、蚯蚓毒性效应进行拟合，计算其20% 抑制率(EC20)和半抑制率(EC50)的毒性阈值。计算方法如下：
b()
1e X M Y Y -=
+
式中：Y 表示生菜株高、根长和生物量抑制率或蚯蚓
死亡率，X 表示HNO 3、EDTA-Na 2、NH 4OAc 和CaCl 2提取态Cu 含量(mg/kg)，M 表示Log ECx(EC20、EC50)；Y 0和b 为模型拟合参数。
试验数据采用Excel 2010 和Origin 9.0 进行分析和处理。
2 结果与讨论
怎么试探一个男人是否喜欢你2.1 农田土壤中Cu 的可提取性比较
4种化学提取剂对土壤中Cu 的提取量存在较大差异。HNO 3提取态Cu 含量范围为2.61 ~ 1 013 mg/kg ，均值为328 mg/kg ；EDTA-Na 2提取态Cu 含量范围为2.17 ~ 1 044 mg/kg ，均值为336 mg/kg ；NH 4OAc 提取态Cu 含量范围为0.03 ~ 317 mg/kg ，均值为62.4 mg/kg ；
914 土壤第52卷
CaCl2提取态Cu含量范围为0.03 ~ 265 mg/kg，均值
为28.2 mg/kg；4种提取剂对土壤Cu的提取量大小
为EDTA-Na2>HNO3>NH4OAc>CaCl2。整体来看，EDTA-Na2和HNO3对土壤中Cu的提取能力较强，NH4OAc和CaCl2对Cu的提取能力较弱。
本研究采用提取态Cu占土壤总Cu含量的百分
数表示不同提取剂对土壤中Cu的提取率，由表3可知，不同土壤中HNO3、EDTA-Na2和NH4OAc对Cu
的提取率大小均为潮褐土>黑土>脱潜水稻土，而CaCl2则相反。同种土壤中，不同提取剂的提取率也
存在显著差异：黑土中，提取率大小为EDTA-Na2> HNO3>CaCl2>NH4OAc；潮褐土中，提取率大小为HNO3>EDTA-Na2>NH4OAc>CaCl2；脱潜水稻土中，
提取率大小为EDTA-Na2>HNO3>NH4OAc>CaCl2。综
合来看，EDTA-Na2和HNO3对3种不同土壤中Cu我爱我自己
提取率均达到40% 以上，NH4OAc和CaCl2对Cu的
提取率低于10%，而CaCl2对潮褐土中的Cu提取率
最弱，平均提取率仅为0.12%。
夏增禄[19]最早对草甸褐土、草甸棕壤、红壤性
水稻土中重金属的有效态提取剂进行了较为系统全
面的研究，结果表明稀酸和络合剂对土壤中重金属的
提取能力较强。李发生等[20]以湖南红壤、重庆紫色
土和河南潮土3种土壤及7种提取剂作为研究对象，
对土壤中重金属的有效态提取剂进行筛选，发现EDTA-Na2提取效果最为明显。易磊等[21]对分别代表
酸性、中性和碱性的水稻土、紫色土、潮土和 土中
的重金属进行提取，发现EDTA-Na2对4种土壤中重
金属的提取能力最强。不同提取剂对土壤重金属的提
取能力差异与其提取机制有关，不同提取剂提取重金
属的形态不同：EDTA-Na2是一种络合型提取剂，可
以把碳酸盐结合态和部分有机结合态、铁锰氧化物结
合态中的Cu提取出来，其对土壤中重金属的提取能名人警句
力较强；HNO3是酸性较强的代换剂，其pH较低，
可以将土壤中的一些非代换吸附态的重金属也提取
出来；而NH4OAc和CaCl2是中性盐试剂，主要提取
水溶态和交换态的Cu，提取率最低[22]。
表3 4种提取剂对不同土壤中Cu的平均提取率
Table 3 Mean extraction efficiencies of Cu in different soils by 4
different extractants
平均提取率(%)
头像搞笑土壤类型
HNO3 EDTA-Na2 NH4OAc CaCl2黑土42.0 51.6 1.88 1.94 潮褐土57.3 56.8 8.70 0.12 脱潜水稻土41.4 45.2 6.52 5.77 2.2 农田土壤中生菜生长状况、可食部位Cu累
积量与土壤提取态Cu含量的关系
在生菜盆栽试验过程中，随着土壤Cu总量的增加，不同土壤中生菜的生长状况逐渐变差。生长初期，Cu高剂量组生菜发芽较晚，生长较为缓慢。随着生长时间的延长，Cu高剂量组生菜出现明显的毒性效应，主要症状表现为叶片发蔫，渐黄，逐渐出现干枯，部分甚至死亡。
生菜的Cu毒害效应在不同土壤中存在差异，除与土壤Cu总量有关外，更大程度上取决于Cu的化学形态和生物有效态含量[23]。图1所示为黑土、潮褐土和脱潜水稻土中不同化学提取态Cu含量与生菜毒害效应的剂量–效应关系。随着化学提取态Cu含量的增加，生菜株高、根长和生物量等呈下降趋势。当化学提取态Cu含量较低时，土壤中Cu对生菜的毒害效应较小；在潮褐土和脱潜水稻土中，低含量的化学提取态Cu甚至出现了一定的刺激生长的作用。相同提取态Cu含量下，潮褐土中生菜的根长、株高和生物量均显著高于黑土和脱潜水稻土，除有效态重金属含量外，土壤本身理化性质也会对其毒性效应产生影响。
通过Log-logistic函数分析了不同化学提取态Cu 含量与生菜Cu富集和毒性效应的相关关系，其相关性系数如表4所示。不同提取态Cu含量与生菜株高抑制率均有显著相关性(R2>0.60，P<0.05)，其相关性大小为CaCl2>EDTA-Na2>HNO3>NH4OAc。CaCl2 和NH4OAc 提取态Cu含量与生菜根长抑制率相关性显著高于EDTA-Na2 和HNO3 提取态Cu含量；其中CaCl2提取态Cu含量与生菜株高和根长抑制率
相关性均达到极显著水平。HNO3、EDTA-Na2和CaCl2提取态Cu含量与生菜生物量相关性显著，相关性大小为CaCl2>EDTA-Na2>HNO3。NH4OAC和CaCl2提取态Cu含量与生菜累积Cu含量显著相关。综合来看，CaCl2提取态Cu含量与生菜Cu富集和毒性效应均具有最好的相关性。已有不少研究报道，CaCl2和NH4OAc提取能很好地表征农田土壤中Cu的生物有效性。Zhang等[24]研究某铅锌矿区污染农田土壤中水稻对Cu的累积与6种化学提取态Cu含量的相关性，结果表明NH4OAc和CaCl2在6种化学提取剂中相关性表现最好。Wang等[25]研究了中国西北绿洲土壤中小麦对Cu的累积与8种化学提取态Cu含量的相关性，发现NH4OAc和柠檬酸提取态Cu相关性最好。本研究则将生菜这一敏感生态受体的Cu富集和毒性效应相结合，通过不同化学提取剂的比较进一步证明
第5期朱侠等：不同性质农田土壤中铜的可提取性与生物有效性及毒性 915
(A：黑土；B：潮褐土；C：脱潜水稻土)
图 1 土壤中不同提取态Cu含量与生菜生物量、株高和根长的关系
Fig. 1 Relationship between soil extractable Cu and lettuce biomass, root length and plant height
