第40卷第2期2021年3月
Vol.40No.2
Mar.2021大连工业大学学报
Journal of Dalian Polytechnic University
DOI:10.ki.dlgydxxb.2021.0203
响应面法优化超声强化黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺
石峰1李佥1田晶1费旭，刘向丽1罗健1张楠陈高俊
(1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；
2.大连工业大学分析中心，辽宁大连116034)
摘要：为研究超声对黑曲霉发酵产柚苷酶的影响，在单因素试验基础上，以超声时期、超声功率、超声
时长、超声次数和超声时间间隔为因变量，柚苷酶活力为响应值，进行五因素三水平的Box-Behnken设
计，采用响应面法优化并获得了超声处理提高柚苷酶发酵活性的最佳工艺条件。结果表明，在超声时期
27h、超声功率160W、超声时长14min、超声次数2次、超声刺激时间间隔13h等最佳工艺条件下，超
声能显著提高柚苷酶活，酶活可达1059.20U/mL，比对照组(860.02U/mL)提高了23.16%。
关键词：超声；柚苷酶活；发酵过程优化；响应曲面法
中图分类号:Q815文献标志码：A文章编号：1674-1404(2021)02-0092-06
Ultrasonic-enhanced naringina fermentation activity via Aspergillus niger
using respon surface methodology
SHI Feng1,LI Qian1,TIAN Jing1,FEI Xu2,LIU Xiangli1,LUO Jian1,
ZHANG Nan1,CHEN Gaojun1
(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian116034,China；
2.Instrumental Analysis Center,Dalian Polytechnic University,Dalian116034,China)
Abstract:The effect of ultrasound on naringina production by AspergiLUs niger was studied. Box-Behnken design with five factors and three levels was carried out on the basis of single factor experiments,with ultrasonic period,ultrasonic power,ultrasonic duration,ultrasonic times and ultrasonic time interval as dependent variables and naringina activity as respon value.The optimal conditions for improving naringina fermentation activity by ultrasound treatment were optimized by respon surface method.The results showed that under the optimal conditions of ultrasonic time 27h,ultrasonic power160W,ultrasonic duration14min,ultrasonic frequency2times,and ultrasonic stimulation interval13h,the activity of naringina was significantly incread by ultrasound,reaching1059.20U/mL,which was23.16%higher than that of the control group (860.02U/mL).
Key words:ultrasonic stimulation；naringina activity;fermentation process optimization；respon surface methodology
收稿日期:2019-07-05.
基金项目：国家自然科学基金项目(31601411).
作者简介：石峰(1992-)，男，硕士研究生；通信作者；李佥(1985-)，女，讲师.
第2期石峰等：响应面法优化超声强化黑曲霉发酵产柚昔酶的工艺93
0引言
柚苷酶是一种重要的生物酶制剂［1］，由-L-鼠李糖苷酶和-D-葡萄糖苷酶组成。柑橘类果汁加工过程中常用柚苷酶进行酶法脱苦，从而改善饮品的风味⑵。a-L-鼠李糖苷酶可将柚柑类果汁中的黄烷酮糖苷类化合物一一柚皮苷（苦味较大）水解成鼠李糖和普鲁宁（苦味较小），普鲁宁可在-D-葡萄糖苷酶的继续作用下生成柚皮素（无苦味）和葡萄糖，使果汁脱苦近年来，随着研究的不断深入，柚苷酶开始被广泛应用于食品和医药工业
研究表明，超声刺激能够有效提高相关酶的产量卩6］。但目前应用超声刺激强化柚苷酶发酵酶活的相关研究鲜有报道。本实验采用超声刺激对黑曲霉发酵产柚苷酶过程进行研究，并通过响应曲面法对相关操作参数进行优化，获得最佳工艺条件，为深入研究新型柚苷酶发酵策略，促进生物食品酶及生物催化的产业化发展提供基础数据和技术支持。
1材料与方法
1.1材料
黑曲霉FFCC uv-11，大连工业大学菌种保藏中心提供；柚皮苷，宝鸡市方晟生物开发有限公司；脱脂
豆粉，大连调味食品厂；其他化学试剂均为分析纯。
绿色运输
1.2培养条件
将低温保存的黑曲霉菌种转接至斜面培养基±,30C恒温培养3d后，取抱子接种于种子培养基中，30C、180r/min培养48h后接种到发酵培养基。改良后的发酵培养基组成（L）［7］: KH2PO4-2H2O1.5g,K2HPO4-12H2O1.5g, MgSO4-7H2O0.5g,（NH4）2SO4 4.0g, ZnSO4-7H2O0.09g,CaCl20.1g，豆粉2.0g，蛋白胨2.0g，酵母浸粉1.0g，柚皮苷6.0g；pH 6.0。
1.3酶活力测定方法
使用Davis法测定发酵培养基中柚苷酶活力［89］0柚苷酶活力定义：在pH 4.5、50C条件下,1min水解1fig的柚皮苷所需的酶量为1个酶活性单位（U/mL）［7］。
1.4超声对黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺优化1.4.1超声工艺
使用超声波清洗机（频率固定为40kHz）对发酵摇瓶进行间歇性超声处理，并通过冷却水循环系统控制超声水浴温度为30C。以未超声处理的试验组为对照组，研究不同超声参数对柚苷酶发酵酶活力的影响。
1.4.2单因素试验
1.4.
2.1超声时期的确定
分别在发酵18、24、30、36、42h时进行超声，功率150W，时长5min，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶活力。
1.4.
2.2超声功率的确定
在最佳超声时期，分别在超声功率125、150、175、200、225W时进行超声，时长5min，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶活力。
1.4.
2.3超声时长的确定
在其他最佳条件下，分别进行3、5、10、15、20min超声，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶发酵酶活力。
1.4.
2.4超声次数的确定
在其他最佳条件下，分别进行1〜4次超声，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶发酵酶活力。
1.4.
2.5超声时间间隔的确定
在其他最佳条件下，分别间隔6、12、18、24h 进行两次超声，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶发酵酶活力。
1.4.3响应面法优化发酵工艺
在单因素试验基础上，通过响应面分析法和Box-Behnken设计试验，以柚苷酶活力作为响应值，以超声时期（A）、超声功率（B）、超声时长（C）、超声次数（D）、超声时间间隔（E）进行五因素三水平的Box-Behnken试验设计，采用响应曲面法分析各因素对响应值的影响。试验因素水平见表1。
Box-Benhnken design models
表1Box-Behnken设计试验因素水平表
Tab.1Code and true values of variables of the
水平
超声
时期/h
P/W
超声时
长/min
超声
次数
间隔
时间/h
A B C D E
-124150516
03017510212
136********
2结果与讨论
2.1超声时期对柚苷酶活的影响
如图1所示，在黑曲霉发酵18h进行超声，柚
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大连工业大学学报
第40卷
苷酶活最低，这可能是因为在发酵前期进行超声处 理使微生物发酵的延滞期延长，相对生长速率降
低，从而影响发酵产物的产生。发酵30 h 进行超声 时，发酵终点柚苷酶活达到最大，为918 3 U/mL 。
发酵时间持续延长，柚苷酶活有所下降，因此确定 最佳超声时期为菌体发酵30 h 。
超声时长/min
图3 超声时长对柚昔酶活的影响
3 Effect of the ultrasonic duration on naringina
activity
(L 2・n )
、ffi ®
o o o o 2 8 4 09 8 8 86020
对照 18 24 30 36 42
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超声时期/h
Fig 图1超声时期对柚昔酶活的影响
Fig. 1 Effect of ultrasonic stimulation stage on
naringinaactivity
2. 1. 2 超声功率对柚苷酶活的影响
如图2所示，随着超声功率的增大，柚苷酶活 不断增加，当超声功率为175 W 时，柚苷酶活达
到最大。而进一步增大超声功率，柚苷酶活快速
降低，可能是因为超声功率的增加使得空化作用 加强，较强的空化作用会对菌体造成损伤，导致菌 体产酶能力降低[0]，这与张泽栋等口门的研究结果
相似，因此选取175 W 为最佳超声功率。
960 ---------------------------------------
2. 1. 4 超声次数对柚苷酶活的影响
如图4所示，当超声次数为2时，柚苷酶活达
到最高，继续增加超声次数，柚苷酶活降低。这可 能是由于适当的超声能够促进菌丝体的生长和次
级代谢产物的合成，但多次刺激会对细胞膜造成 损伤[3]，因此确定最佳超声次数为2。
1 100 ---------------------------------------
(L 2・n )
、ffi ®
o
o
o o 9 870
00超声次数
4
3
图4 超声次数对柚昔酶活的影响
(L 2・n )、ffi ®
80
88
84
92对照 125 150 175 200 225
宝宝脸上长红点图2 超声功率对柚昔酶活的影响
Fig. 2 Effect of ultrasonic power on naringina activity
2. 1. 3 超声时长对柚苷酶活的影响
如图3所示，在超声功率一定的情况下，随着
超声时长的增加，柚苷酶活不断增加，当超声时长 为10 min 时，柚苷酶活达到最大。当超声时长继 续延长时，柚苷酶活显著降低，这可能是因为过度
的超声会造成细胞损伤[2]，导致产酶能力下降。
因 此 选 取 10 min 为 最 佳 超声 时 长 。
Fig 4 Effect of ultrasonic times on naringina activity
2. 1. 5 超声时间间隔对柚苷酶活的影响
如图5所示，当超声时间间隔为12 h 时柚苷
酶活达到最大，继续延长超声时间间隔会导致柚 苷酶活的降低，这可能是由于超声时间间隔的延 长使得菌体对超声的反应减弱，进而导致柚苷酶
(
L 2・n )
、ffi ®
间隔时间/h
图5 超声时间间隔对柚昔酶活的影响
Fig. 5 Effect of ultrasonic interval on naringina
activity
第2期石峰等：响应面法优化超声强化黑曲霉发酵产柚昔酶的工艺95
活的下降。因此确定最佳超声时间间隔为12h。
2.2响应面法优化工艺
以超声时期（A）、超声功率（B）、超声时长（C）、超声次数（D）、超声时间间隔（E）为试验因
素，以柚苷酶活为响应值进行五因素三水平的Box-Behnken设计，采用响应曲面法对超声强化柚苷酶活的工艺进行优化。Box-Behnken设计由46个试验组组成，包括40个因子点和6个中心点，响应面试验方案及结果如表2所示。
我怎么办
表2响应曲面试验方案与结果
Tab.2Experimental scheme and results of RSM
编号A B C D E酶活/(U-mL-1)编号A B C D E酶活/(U-mL-1) 1000111040.4124001-101025.89
2-100-10990.62250-10011031.55 3101001014.98261-10001010.15 4001011042.442700-1-101027.70
500-10-11038.6328-1000-11033.15 611000997.52290-11001034.81
70-100-11023.2230000001060.18 80001-11024.4131-100011008.41
900-1101012.8132-101001026.62
100-10101033.27330-10-101001.26
11-1-1000994.4434-10-100986.25 12000-1-11050.75350-1-1001000.94
13-11000982.3036000001061.12 14000001053.153710-1001019.58 150100-11026.82381000-11021.25 1601001998.6239-100101038.27 1701-1001011.8940011001004.72 180********.054100-1011015.00 19000001063.984210010998.12 20100011025.1943001101051.56 21000001054.5344010-101016.74 22000-111022.7545100-101043.03 230010-11043.114601010985.37
2.2.1数学模型建立
使用Design-Expert&0.6软件对试验数据进行回归拟合，得到柚苷酶活与各因素间的二元回归方程：
N=105&34+4.36A-6.60B+&21C+宋玉泉
0.34D—4.81E-012AB-11.24AC-
23.14AD+7.17AE-10.26BC-
15.84BD-9.13BE+10.14C D+
5.74C E+11.00DE-29.06A2-
32.09B2-15.14C2-14.64D—7.74E2 2.2.2方差分析
过年祝福语由表3可知，F值为64.75,P<10-4（显著），说明回归方程与响应值之间的关系模型显著；失拟项P值为0.5851,P>0.05（不显著），表明模型稳定，拟合度良好⑷；模型校正系数R Aj=0.9659，该回归方程具有统计学意义，可以比较准确地预测最佳超声工艺参数，且预测值能够较好地与实际值相匹配。
由表4可知，对响应值产生影响的5个因素对柚苷酶活的影响作用由大到小依次为B、C、E、A、D，其中B、C、E三项影响极显著（P<10-4）,A 影响显著（P<0.05）,D影响不显著（P>0.05）；
A、B、C、E各因素平方项对响应值的影响都达到极显著水平，所以超声时机、超声功率、超声时长和超声间隔时间对柚苷酶活的影响较大。
2.2.3响应面分析
使用Design-Expert&0.6软件绘制出各因素对响应值影响的三维曲面图，如图6所示。可以看出，超声时期、功率、时长和时间间隔都存在相关性，所有的曲面图均为开口向下的凸面，并存
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大 连 工 业 大 学 学 报
第40卷
注”代表差异显著(P C0. 05) ； * * ”代表差异极显著(P C0. 01)。
表3响应曲面回归模型方差分析
Tab.3
Variance analysis of RSM regression equation
变异来源平方和自由度均方
F 值P 值
模型21384.18
20
1069.2164.75<10-4 **A 304.151304.15
18.422X 10-4 **
B 697.751697.75
42.25<10-4 **C
1077.97
11077.97
65.28
<10-4 **D 1.881 1.880.110.7388
E 370.27
1370.27
22.42<10-4 **AB 0.0610.06 3635 X 10-3
0.9524
航天员怎么画AC
505.581505.5830.62<10-4 **AD 2141.84
12141.84
129.70
<10-4 **
AE
205.641205.64 2.450. 001 6**BC 421.071421.07
25.50
<10-4 **BD
1004.26
11004.2660.81<10 — 4 **
BE 333.611333.61
20.20]0 — 4 * *
CD
411.281411.2824.90<10 —4 **
CE 131.79
1131.79
7.98
0 0092**DE
484.001484.0029.31
<10 —4 **A 27372.05
17372.05446.41<10 —4 **B 2
8984.6218984.62
544.06<10 —4 **C 22001.2912001.29121.19<10 —4 **D 21870.67
可乐配方11870.67
113.28
<10 —4 **E 2
523.481523.4831.70
<10 —4 **
残差412.852516.51失拟项326.812016.34
0.950 5851
纯误差
86.04
5
17.21
总和21797.0345
标准差
4.06均值
1024.01
变异系数
0.40
R 20.9811R d
0.9659预测决定系数
0.9343信噪比
26.219
在最高点，说明在试验考察范围内存在最大的柚 苷酶活响应值。
由图6(a)可以看出，当超声功率、超声次数和
超声时间间隔为零水平时，随着A 和C 的增大，柚 苷酶活呈现出先增高后降低的趋势；由图6(b)可
以看出，当其余因素处于零水平时，随着A 和E 的增大，柚苷酶活达到最大酶活后快速降低，A 、E 表现出对柚苷酶活的非线性影响；由图6(c)可以
看出，随着B 和C 的增大，柚苷酶活快速增大，后 趋于平缓，响应曲面的坡度较陡，B 、C 对柚苷酶活 的影响显著；图6(d)为C 、E 对柚苷酶活的交互影 响。总体来说，各因素的交互影响效果明显，等高
线都呈现椭圆形，说明该响应面优化设计能够合 理反映出各因素对响应值的影响。
2.2.4 最佳超声工艺的确定和验证试验
最佳超声刺激工艺条件：超声时期27. 25 h 、
超声功率160. 12 W 、超声时长14. 43 min 、超声次 数2.83、超声时间间隔13.02 h，柚苷酶活的理论预
测值最高可达1 064. 19 U/mL 。结合实际试验条
件，确定超声强化黑曲霉发酵生产柚苷酶的最佳工 艺参数为超声时机27 h 、超声功率160 W 、超声时 长14 min 、超声次数2次、超声间隔时间13 h 。在
该工艺条件下测得柚苷酶活为1 059.20 U/mL, 与预测值非常接近。
