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基金项目：长沙市第一医院院级科研基金项目（No.Y2014-03）。
作者简介：左清平，女，硕士，主要从事肝病的防治研究，E-mail ： *通讯作者：刘世坤，男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事临床药学研究，Tel ：（0731）88618496，E-mail ：
姜黄素抑制NF -κB 信号对人肝癌HepG 2细胞株增殖的影响
左清平1，张顺芝1，刘世坤2*（1.长沙市第一医院药剂科，长沙 410005；2.中南大学湘雅三医院药剂科，长沙
410013）
摘要：目的 探讨姜黄素对HepG 2细胞株增殖的影响及其机制。方法 不同浓度的姜黄素（0、1.0、3.0、
5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μmol ・L －1）处理HepG 2细胞株不同时间后，MTT 法检测肝癌细胞株增殖情况；RT-PCR 检测NF-κBp65和hTERT mRNA 表达；Western blot 检测hTERT 蛋白表达，细胞
免疫荧光法检测HepG 2肝癌细胞株中NF-κB 活性。结果 姜黄素能明显抑制HepG 2细胞的增殖，且呈时间与浓度依赖性； 姜黄素能显著抑制NF-κB p65 mRNA 表达及活性，同时伴有hTERT mRNA 及蛋白表达降低。结论 姜黄素抑制肝癌细胞株增殖，可能通过抑制NF-κB p65调控hTERT 表达，进而下调端粒酶活性有关。关键词：姜黄素；肝癌HepG 2细胞；NF-κB ；hTERT
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-2981(2015)04-0348-04doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2015.04.003
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（收稿日期：2014-12-05；修回日期：2015-01-18）
姜黄素（curcumin）是从姜科姜黄属植物中提取的一种天然酚类色素。大量的体外研究已经证实，姜黄素能诱导包括白血病、淋巴瘤、肺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和直肠癌等在内的多种人类肿瘤细胞株发生凋亡[1-4]，具有抗炎的作用，同时发现姜黄素与化疗药物联用能增加药物敏感性，但是关于姜黄素抑制肝癌细胞株增殖的作用及其分子机制研究却很少报道。本文为进一步探讨姜黄素在人肝癌HepG2细胞中对肝癌细胞增殖的影响及对NF-κB和NF-κB下游信号分子hTERT表达的影响进行了研究。
1 材料
1.1 试药
NF-κB激活-核转运检测试剂盒（SN368，上海碧云天）；抗hTERT抗体（美国Epitomics公司）；抗β-actin 抗体（上海中杉金桥生物技术有限公司）；姜黄素（美国Sigma公司）；细胞裂解液（美国Invitrogen公司）；总RNA抽提试剂盒（SK1351）逆转录试剂盒（K1621）（上海生物工程技术服务有限公司）和PCR试剂盒（K0171）（MBI Fermentas公司）。
1.2 细胞系
HepG2肝癌细胞株（中南大学药学院药理教研室惠赠），常规培养于含10%小牛血清的DMEM高塘
培养基中。在5%CO2，37 ℃和100%湿度条件下的培养箱内孵育，每2日换液，每3～4日传代，使细胞密度维持在70%～80%满盘状态。
2 方法
2.1 细胞增殖实验（MTT法）
MTT法检测不同浓度（0、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μmol・L－1）姜黄素作用于HepG2细胞12、24、36 h后对HepG2细胞增殖的抑制效应。将细胞（1×105个/孔）接种于96孔板内，8 h后，细胞以0、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μmol・L－1姜黄素处理12、24、36 h之后在每个细胞培养孔中加入10 μL 5 mg・mL－1的MTT溶液，于37 ℃孵育4 h。弃去上清液，每孔加200 μL DMSO，由Biorad自动酶标仪在450 nm处测定OD值。 增殖抑制率/%＝
OD给药组－OD对照组
×100%。
OD对照组
2.2 PCR引物及 RT-PCR
按照 Invitrogen试剂盒说明提取各组细胞总RNA，用逆转录试剂盒按说明将RNA逆转录为cDNA。RT-PCR 体系20 μL：cDNA 2 μL、PCR mix 10 μL、上下游引物各0.2 μL，加入双蒸水至总体积20 μL。以β-actin为内参，用X线曝光显影，并利用公式2－△△ Ct 定量计算各基因的相对表达量。引物序列，产物大小及退火温度见表1。
雨霖铃原文
Inhibition of curcumin on NF-κB and the growth of human HepG 2 cells ZUO Qing-ping1, ZHANG Shun-zhi1, LIU Shi-kun2*(1. Department of Pharmacy, First Hospital of Changsha, Changsha 410005; 2. Department of Pharmacy, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013)
Abstract: Objective To determine the regulatory effect of curcumin on NF-κB and hTERT gene in HepG
2
cells, and to explore the antiproliferation mechanism of curcumin. Methods The expression of hTERT gene and NF-κB gene was analyzed by RT-PCR. Western blot was ud to determine the protein expression of hTERT. NF-κB activity was measured with immunofluorescent microscopy. Results Curcumin inhibited NF-κB and hTERT expression.
Conclusion Curcumin inhibits NF-κB activation and expression of hTERT in HepG
2
cells in vitro. NF-κB may
modulate hTERT at transcription level in HepG汽车知识入门大全
2
cells, and then cut the telomera activity.
Key words: curcumin; human HepG
2
Cell; NF-κB; hTERT
表1 引物序列
Tab 1 Primer quence
引物名称（name of primer）
引 物 序 列
（primer quence）
产物大小
（product size）/bp
退火温度
（annealing temperature）/℃
p65上游 5'-GCCGAGTGAACCGAAAC-3'47456下游 5'-GGGATGACGTAAAGGGATAG-3'
hTERT上游 5'- CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'14560下游 5'- GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'dnf改名
β-actin上游 5'- AAATCGTGCGTGACATTAA-3'47357下游 5'- CTCGTCATACTCCTGCTTG-3'
2.3 Western印迹法
取各组对数生长期细胞，按2×106个/培养皿接种细胞。收集细胞，加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4 ℃下12 000 r・min－1离心40 min，取上清液，提取蛋白。取50 μg蛋白在SDS-PAGE电泳下分离，转膜，分别孵育一抗hTERT、二抗后，洗膜后加入ECL试剂，用X线曝光显影。并用图像分析测定各带吸光度（A）值作定量分析。
2.4 细胞免疫荧光
生长良好的各组细胞按NF-κB激活-核转运检测试
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表3 姜黄素对HepG 2细胞中NF-κBp65 mRNA 的相对表达Tab 3 Effect of curcumin on expression of NF-κBp65 mRNA in HepG 2 cells
浓度（concentration ）/μmol ・L －1
NF-kB p65 mRNA 的相对表达（relative expression of NF-kB p65 mRNA ）
0.392 5±0.010 041.0 0.321 8±0.003 06*3.0 0.157 2±0.002 28*5.0
0.133 1±0.006 61*
注：* P ＜0.05，与对照组相比。
Note ： *P ＜0.05，compared with the control group.
表4 姜黄素对HepG 2细胞hTERT mRNA 的相对表达Tab 4 Effect of curcumin on expression of hTERT mRNA in HepG 2 cells
浓度（concentration ）/μmol ・L －1
hTERT mRNA 的相对表达（relative expression of hTERT mRNA ）
0.398 8±0.024 411.0 0.301 2±0.020 34*3.0 0.271 6±0.010 12*5.0
0.201 0±0.010 25*
注：*P ＜0.05，与对照组相比。
童话故事英文Note ：*P ＜0.05，compared with the control group.
图2 姜黄素对HepG 2细胞hTERT mRNA 表达的影响
Fig 2 Effect of curcumin on the mRNA expression of hTERT genes
mark control 1.0 3.0 5.0 control 1.0 3.0 5.0
β-actin
NF -κBp65
姜黄素μmol ・L －1
剂盒用PBS 洗涤，固定，加入1 mL 免疫染色封闭液。分别孵育NF-κB p65抗体与抗兔Cy3后，洗涤后加入细胞核染色液（DAPI ），细胞核染色液吸除并洗涤后加入适当量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察。NF-κB 的染色为红色荧光，细胞核的DAPI 染色为蓝色荧光。对每组细胞产生的不同颜色的荧光强度进行定量分析。2.5 统计学处理
数据用平均值±标准差（x ±s ）表示。2组间数据用采用One-way ANOV A Newman-test 多重比较t 检验分析。应用SPSS 16.0 统计软件包对数据进行统计分析。双侧P ＜0.05认为差异有统计学意义。3 结果
3.1 姜黄素抑制人肝癌HepG 2细胞株增殖
MTT 法实验结果显示（见表2），从剂量方面观察，在相同的时间点，10.0、20.0、50.0、100.0 μmol ・L －1 姜黄素处理后均可明显抑制HepG 2细胞株的增殖，与对照组相比差异有统计学意义（P ＜0.05），且抑制效应与浓度呈正相关。而1.0、3.0、5.0 μmol ・L －1 的抑制作用与对照组相比，差异无统计学意义（P ＞0.05）。从时间方面观察，在相同浓度姜黄素处理HepG 2细胞株，即浓度范围为10.0～100.0 μmol ・L －1内的任意某一浓度处理HepG 2细胞株24、36 h 后，HepG 2细胞增殖明显抑制，与12 h 组相比差异有统计学意义（P ＜0.05）。＜5 μmol ・L －1
培养24、36 h 后细胞增殖无明显减低，与12 h 组相比差异无统计学意义（P ＞0.05），且HepG 2细
胞生存率＞80%。因此，后续实验中选择姜黄素的干预浓度为1.0、3.0、5.0 μmol ・L －1。
表2 姜黄素对细胞的毒性作用(x ±s ，n ＝5)Tab 2 Effect of curcumin on cell cytotoxicity (x ±s ，n ＝5)浓度（concentration ）/μmol ・L －1抑制率（inhibition rate ）/%
12 h 24 h 36 h 0（对照组）0.00±3.080.00±2.170.00±7.82 1.0 2.34±5.10 2.47±5.79 2.74 ±4.92 3.0 3.61±4.21 3.88±3.48 3.91±6.86 5.0 4.72±5.88 4.81±5.34 4.88±4.25 10.010.73±5.35*14.76±3.18*#21.09±2.04*# 20.018.76±3.27*21.42±4.69*#38.19±2.71*# 50.030.45±5.28*41.71±5.32*#57.34±4.01*# 100.044.01±6.16*
59.14±3.05*#
67.14±6.11*#
注：*P ＜0.05，与对照组相比；# P ＜0.05，与干预12 h 实验
组相比。
Note ： *P ＜ 0.05，compared with the control group ； # P ＜ 0.05，compared with the 12 h intervention group.
3.2 姜黄素对HepG 2细胞中NF-κBp65 mRNA 表达及NF-κB 活性的影响
不同浓度（1.0、3.0、5.0 μmol ・L －1）的姜黄素作用HepG 2细胞36 h 后，剂量依赖性的抑制NF-κBp65 mRNA 的表达（见图1），且明显低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05，见表3）。
采用免疫荧光染色技术检测NF -κB 活性，姜黄素作用细胞36 h 后，红色荧光强度明显减弱，NF -κB 入核量图1 姜黄素对HepG 2细胞中NF-κBp65 mRNA 表达
Fig 1 Effect of curcumin on expression of NF-κBp65 mRNA in HepG 2 cells
mark control 1.0 3.0 5.0 control 1.0 3.0 5.0
四年级下册数学应用题
β-actin NF -κBp65
姜黄素μmol ・L －1大量减少，活性被阻断。姜黄素对NF -κB 活性影响与RT-PCR 检测NF-κBp65结果是一致的。定量分析显示在姜黄素作用下，Cy3产生的荧光强度为8.7±1.7，与对照组（14.1±1.5）相比差异有统计学意义（P ＝ 0.000）。NF-κBp65大量入核被激活。
3.3 姜黄素对hTERT 基因表达的影响
不同浓度（1.0、3.0、5.0 μmol ・L －1）的姜黄素处理HepG 2细胞36 h ，能剂量依赖性下调HepG 2细胞中hTERT mRNA 的表达，且与对照组相比，差异有统计学意义（P ＜0.05）（见图2及表4）。
冲破牢笼 为了进一步探讨姜黄素对HepG 2细胞hTERT 的影响，使用3.0 μmol ・L －1姜黄素处理细胞36 h 后，用W estern blot 检测细胞内hTERT 蛋白的变化。实验结果见图3，3.0 μmol ・L －1姜黄素作用HepG 2细胞后，能明显下调细胞内hTERT 蛋白的表达水平（0.279 1±0.013 01），且明显低
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4 讨论
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC ）是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，发生率正呈上升趋势。常规的抗癌药物对肝癌的治疗效果不理想且易产生耐药性，因此，寻找安全低毒药理作用广泛的天然药物成为该领域研究热点之一。
姜黄素在自然界广泛存在且易于提取，原料成本低廉，安全低毒，是一种具有良好发展前景的天然抗癌药物。目前姜黄素抗肿瘤己成为研究热点，体内外实验研究可抑制多种肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管形成以及预防肿瘤发生等抗肿瘤作用，但其中机制尚不明确[5-7]。前期工作
已经证实，NF -κB 抑制剂作用于肝癌细胞，能明显抑制NF-κB mRNA 表达及活性，且能降低hTERT mRNA 及蛋白表达，导致细胞增殖抑制，相反，使用NF-κB 激活剂作用于肝癌细胞后，NF -κB 的表达及hTERT 的表达相应增强[8]。研究证实，姜黄素能抑制肿瘤细胞内NF -κB 表达[9]，在此基础上我们进一步探讨了姜黄素对肝癌细胞的作用及机制。
结果表明：姜黄素能够明显抑制HepG 2细胞的恶性增殖。其机制可能是通过下调 NF-κBp65 mRNA 的表达，降低NF -κB 活性并进一步抑制HepG 2细胞内hTERT 的mRNA 及蛋白质表达，从而导致细胞增殖受阻。此研究与姜黄素能抑制细胞增殖，其机制可能系通过阻断NF -κB 信号通路有关结果一致[9]。且在此基础上进一步证实了姜黄素不仅能抑制NF -κB 表达，还能进一步影响NF -κB 信号通路下游基因hTERT 表达。肝癌细胞增殖、调控、获得永生的关键在于端粒酶逆转录酶（hTERT ）的激活[10]。且癌变过程中hTERT 蛋白的表达变化与端粒酶活性升高的趋势基本一致，并呈正相关[11]。因此，推测姜黄素抑制HepG 2细胞的增殖是通过对端粒酶调控介导的。
当然，关于姜黄素作用NF-κB 后是通过何种路径影响与hTERT 表达，对hTERT 转录调节是直接还是间接与hTERT 上启动子结合，共同调节hTERT 转录抑制肿瘤细胞的增殖尚需要更多的实验进行说明。这也是本研究需要进一步深入探讨的问题，而本次研究为深入认识姜黄素对NF-κB 信号通路的影响提供一定的实验基础。参考文献
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图3 姜黄素对HepG 2细胞hTERT 蛋白的影响
Fig 3 Effect of curcumin on the protein expression of hTERT in HepG 2 cells
姜黄素3 μmol ・L －1
control hTERT
β-actin
于对照组（0.715 1±0.015 78），两者差异有统计学意义（P ＝ 0.000）。
