论著 临床研究
探讨质谱M RM 方法对于糖化血红蛋白准确测定的应用∗
艾滋病传播途径宋智心１，王㊀默２，张顺利２，张㊀瑞２，马怀安３，张景丹１，王清涛２
(１．北京市房山区良乡医院，北京１０２４０１;２．首都医科大学附属北京朝阳医院，北京１０００２０;
３．中国中医科学院眼科医院，北京１０００４０
)㊀㊀摘㊀要：目的㊀应用质谱多反应监测扫描(M R M )
技术准确测定糖尿病患者体内糖化血红蛋白的水平.方法㊀在国际临床化学和实验室医学联盟(I F C C )推荐的质谱法测定糖化血红蛋白参考方法的基础上，利用I F C C 参考实验室一级校准物质绘制标准曲线，使用质谱单离子检测扫描(S I M )和M R M ２种模式测定I F C C 参考实验室国际比对样本及临床患者标本，计算２种方法的均值㊁精密度和偏倚，评价质谱MR M 方法测定糖化血红蛋白的优势.结果㊀在S I M 和MR M２种监测模式下,
均以峰面积为计算依据，横坐标为峰面积比值，纵坐标为浓度C O N C 比值，绘制标准曲线，在给定的浓度范围内,２种检测方法r ２
分别为０．９９８８和０．９９９２；测定I F ＧC C 参考实验室国际比对样本中糖化血红蛋白的水平,S I M 模式下，精密度为０．７７％~１．８１％，偏倚为－０．３５~
０．３０m m o l /m o l ;M R M 模式下，精密度为０．８１％~１．８４％，偏倚为－０．２０~０．４０m m o l /m o l .结论㊀在质谱法测定血液样本中糖化血红蛋白水平时，应用M R M 监测模式可以获得与S I M 模式一致的结果，检测值和精密度等监测结果均符合I F C C 参考实验室国际比对要求，同时灵敏度和信噪比进一步提升，抗干扰能力更好，应用前景广阔.
关键词：质谱多反应监测扫描质谱法;㊀糖化血红蛋白测定;㊀参考方法;㊀糖尿病
D O I :１０．３９６９/j
．i s s n ．１６７３Ｇ４１３０．２０１８．２２．００３中图法分类号:R ５８７．１;R ４４６．１
文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１８)２２Ｇ２７２９Ｇ０５
文献标识码:A
T h e a p p l i c a t i o no fm a s s s p e c t r o m e t r y M R Mt o t h e a c c u r a t e d e t e r m i n a t i o no f g l y c o s y l a t e dh e m o g
l o b i n ∗
S O N GZ h i x i n １,WA N G M o ２,Z HA N GS h u n l i ２,Z HA N GR u i ２,MA H u a i ᶄa n ３,
Z HA N GJ i n g d a n １,WA N GQ i n g
t a o ２
(１．D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,L i a n g x i a n g H o s p i t a l o f B e i j i n g F a n g s h a n D i s t r i c t ,B e i j i n g １０２４０１,C h i n a ;２．B e i j i n g C h a o y a n g H o s p i t a lA f f i l i a t e d t oC a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t y ,
B e i j i n g １０００２０,
C h i n a ;３．
D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,O p h t h a l m o l o g y
H o s p i t a l o f C h i n e s eA c a d e m y o f C h i n e s eM e d i c a lS c i e n c e s ,B e i j i n g １
０００４０,C h i n a )A b s t r a c t :O b j
e c t i v e ㊀T o a c c u r a t e l y d e t e r m i n e t h e c o n t e n t o
f
g l y c o s y l a t e d
h e m o g l o b
i n (H b A １c )i n p a t i e n t s w i t hd i a b e t e s m e l l i t u sb y m u l t i Ｇr e a c t i o n m o n i t o r i n g (M R M )t e c h n i q
u e ．M e t h o d s ㊀B a s e do nt h er e f e r e n c e m e t h o d r e c o m m e n d e db y I F C Cf o r t h ed e t e r m i n a t i o no f g l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i nb y m a s ss p e c t r o m e t r y
,t h e s t a n d a r d c u r v ew a s d r a w nb y u s i n g t h e p r i m a r y c a l i b r a t i o nm a t e r i a l o f I F C Cr e f e r e n c e l a b o r a t o r y
,a n d t h e i n Ｇt e r n a t i o n a l c o m p a r a t i v e s a m p l e s a n d c l i n i c a l p a t i e n t s a m p l e s o f I F C Cr e f e r e n c e l a b o r a t o r y w e r e d e t e r m i n e db y
s i n g l e i o nm o n i t o r i n g (S I M )a n d M R M．C a l c u l a t e t h em e a n ,p
r e c i s i o na n db i a so f t h e t w om e t h o d s ．R e s u l t s ㊀T h e s t a n d a r d c u r v e sw e r e d r a w n u n d e r t h e S I Ma n dMMRm o n i t o r i n g m
o d e sw i t h t h e p e a k a r e a a s t h e c a l c u l a Ｇt i o nb a s i s ,t h e a b s c i s s aa s t h e p e a ka r e ar a t i o ,a n dt h eo r d i n a t ea s t h ec o n c e n t r a t i o nC O N Cr a t i o ．W i t h i nt h e g i v e n c o n c e n t r a t i o n r a n g e ,t h e t w oR ２w e r e０．９９８８a n d０．９９９２,r e s p e c t i v e l y ．T h e g l y c o s y l a t e dh e m o g
l o b i n c o n t e n t a n d t h e S I M m o d e l w e r e d e t e r m i n e d i n t h e i n t e r n a t i o n a l c o m p a r i s o n s a m p l e s o f I F C C r e f e r e n c e e x p
e r i Ｇm e n t s ．T h eC V w e r e ０．７７％－１．８１％,T h eb i a sw a s －０．３５－０．３０m m o l /m o l ;a n dt h eC V w e r e０．８１％－
１．８４％a n d t h eb i a s i n M R M m o d ew a s －０．２０－－０．４０m m o l /m o l ．C o n c l u s i o n ㊀I nt h ed e t e r m i n a t i o no f
H b A １c i nb l o o d s a m p l e s b y m a s s s p e c t r o m e t r y ,M R M m o n i t o r i n g m
o d e l c a nb eu s e d t oo b t a i nc o n s i s t e n t r e Ｇs u l t sw i t hS I M．T h e d e t e c t i o n v a
l u e s a r e i n l i n ew i t h t h e i n t e r n a t i o n a l c o m p a r i s o n r e q
u i r e m e n t s o f I F C C r e f e r Ｇ
９２７２ 国际检验医学杂志２０１８年１１月第３９卷第２２期㊀I n t J L a bM e d ,N o v e m b e r ２０１８,V o l ．３９,N o ．２２
∗
基金项目：首都临床特色应用研究项目(Z １５１１００００４６１５００１
海字开头的成语).㊀㊀作者简介：宋智心，女，副主任技师，主要从事生物化学标准化方面的研究.㊀ә㊀通信作者,E Ｇm a i l :l i l y s o n g
１９７８＠１２６．c o m .㊀㊀本文引用格式：宋智心，王默，张顺利，等．探讨质谱M RM 方法对于糖化血红蛋白准确测定的应用[J ]．国际检验医学杂志,２０１８,３９(２２)
:２７２９Ｇ２７３２．
e n c e l a b o r a t o r y．T h e s e n s i t i v i t y a n d s i g n a lＧt oＧn o i s e r a t i oa r e
f u r t h e r i m p r o v e d,a n d t h e a p p l i c a t i o n p r o s p e c t i s
g o o d．
K e y w o r d s:m u l t iＧr e a c t i o nm o n i t o r i n g m a s s s p e c t r o m e t r y;㊀g l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i n;㊀r e f e r e n c em e t h o d;㊀d i a b e t e sm e l l i t u s
㊀㊀目前，国际上定义糖化血红蛋白(H b A１c)化学构成为葡萄糖稳定的连接在血红蛋白(H b A０)β链N末端缬氨酸(V a l)残基上，即血红蛋白(血液)ＧNＧ(１Ｇ脱氧果糖基)血红蛋白β链[１].
H b A１c作为糖尿病患者长期血糖控制的重要指标，长期以来一直受到临床医生的广泛关注[２]，其参考方法一直沿用国际临床化学联合会(I F C C)推荐的液相色谱串联质谱或液相色谱串联毛细管电泳[３]，本研究在I F C C推荐的质谱法测量H b A１c的基础上，利用质谱多反应监测(M R M)技术，选择了二级质谱二个离子对,H b A０的质荷比(m/z)为３４８．２ң１１０和H b A１c的m/z为４２９．２ң２４５，替代了单反应监测(S I M)中H b A０的m/z为３４８．２和H b A１c的m/z为４２９．２，获得了准确一致的结果，抗干扰能力强，标本处理方法简便[４]，有望成为H b A１c准确测定的新方法.
１㊀资料与方法
１．１㊀一般资料㊀所有临床标本均来自北京朝阳医院和良乡医院的健康体检患者，空腹采集新鲜乙
二胺四乙酸二钾(E D T AＧK２)抗凝静脉血，经筛查人类免疫缺陷病毒(H I V)抗体㊁乙型肝炎表面抗原(H B s A g)和丙型肝炎病毒表面抗原(H C V)均为阴性，依据I F C C推荐的H b A１c参考测量方法实验流程处理血液标本８支(S１~S４，各２支);I F C C H b A１c网络参考实验室比对样本１８支(包括M e l b o r u m e８㊁B e r l i n１㊁C a l i f o rＧn i a１㊁C a l i f o r n i a８和M i l a n o６~１０，各２支);I F C C一级校准物P c a lA~F共６支，浓度范围０~１５０m m o l/ m o l.
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１．２㊀仪器和试剂㊀１２９０Ｇ６４９０三重四级杆质谱仪来自安捷伦科技(中国)有限公司(液相色谱和质谱参数见表１)，仪器处于最佳工作状态.有机化学试剂(甲酸㊁甲醇㊁乙腈)均为H P L C等级，购自默克公司;e nＧd o p r o t e i n a s eG L UＧC为测序等级，购自罗氏诊断；醋酸㊁乙酸胺㊁βＧ吗啉代乙磺酸㊁E D T AＧK２㊁磷酸㊁氯化钠㊁氢氧化钠等，均为分析纯(A R)，购自北京化工有限公司.
１．３㊀方法㊀在２个独立的工作日，将全部血液样品按细胞内蛋白G l uＧC２００μg/m L,３７ħ酶解１８h以上,－２０ħ冻存终止反应，获得酶解产物.将酶解物室温放置２０m i n后，应用I F C C推荐的液相色谱串联三重四级杆质谱法测定所有实验标本,S I M模式下监测m/z为３４８．２(H b A０)和４２９．２(H b A１c)，计算峰面积比值；同时选择M R M模式下监测了二级质谱H b A０m/z为３４８．２ң１１０,H b A１c的m/z为４２９．２ң２４５，计算对应峰面积比值；每个样本重复测定３次，利用m/z峰面积比值计算样本中H b A１c的水平.１．４㊀统计学处理㊀采用S P S S１３．０统计
软件进行统计分析，对各组数据进行正态性检验，符合正态分布的数据采用xʃs表示.
２㊀结㊀㊀果
２．１㊀S I M与M R M模式下测定H b A１c的液相色谱和质谱条件㊀见表１.
表１㊀㊀液相色谱和质谱条件
色谱条件参数质谱条件参数
流动相A：水(水＋０．１％甲酸)扫描类型S I M/M R M
B：甲醇C A P电压３５００V
梯度０m i n㊀１０％B；喷雾气体氮气
３m i n㊀３０％B；喷雾器压力２４１k P a
４m i n㊀９５％B；气体流速１５L/m i n
６m i n㊀９５％B；气体温度３７０ħ
６m i n１０s㊀１０％B；扫描范围３００~２０００m/z
８m i n㊀１０％B;
流速４００μL/m i n
２．２㊀S I M与M R M模式下测定H b A１c色谱图的比较㊀以对应m/z的峰面积作为计算依据，其中图１为S I M方法测定的H b A１c色谱图，对应m/z为４２９．２；图２为S I M方法测定的H b A０色谱图，对应m/z为３４８．２；图３为M R M方法测定的H b A１c色谱图，对应m/z为４２９．２ң２４５；图４为M R M方法测定的H b A０的色谱图，对应m/z为３４８．２ң１１０.由色谱图可以看到２种模式下均可以获得均匀光滑的色谱峰，并且MR M监测模式下H b A１c杂峰比较少.
㊀㊀注:C A L AＧC A L F为I F C C H b A１c一级标准物质，浓度分别为０㊁２９．４㊁５８．３㊁８７．６㊁１１６．６㊁１４６．７m m o l/m o l)
图１㊀㊀S I M方法测定的H b A１c色谱图
０３７２ 国际检验医学杂志２０１８年１１月第３９卷第２２期㊀I n t J L a bM e d,N o v e m b e r２０１８,V o l．３９,N o．２２
图２㊀㊀S I M 方法测定的H b A ０
色谱图
㊀㊀注:C A L A ＧC A L F 为I F C C H b A １c 一级标准物质,
浓度分别为０㊁２９．４㊁５８．３㊁８７．６㊁１１６．６㊁１４６．７m m o l /m o l
如何组合图片
)图３㊀㊀M R M 方法测定的H b A １c
色谱图
图４㊀㊀M R M 方法测定的H b A ０色谱图
２．３㊀S I M 与M R M 方法测定H b A １c 标准曲线的绘
制㊀在S I M 模式下，以峰面积为计算依据，横坐标为H b A １c :H b A ０浓度C O N C 比值，纵坐标以m /z 峰面
积比值(４２９．２/３４８．２)，绘制标准曲线，见图５；在M R M 模式下,
以峰面积为计算依据，横坐标以H b A １c :H b A ０浓度C O N C 比值；纵坐标为m /z 峰面积比值(４２９．２ң２４５/３４８．２ң１１０)
，绘制标准曲线，见图６;２种方法r ２
分别为０．９９８８和０．９９９２，线性相关性良好.
２．４㊀S I M 与M R M 模式测定样本中H b A １c 水平的
比较.以I F C C 参考实验室国际比对样本M e l b o Ｇ
r u m e ８㊁B e r l i n １㊁C a l i f o r n i a １㊁C a l i f o r n i a ８为质控品,
测定I F C C 国际比对样本(M i l a n o６~１０)和临床血液标本中H b A １c 水平，见表２;S I M 模式下，偏倚为
近水楼台的意思－０．３５~０．３０m m o l /m o l ,M R M 模式下，偏倚为
－０．２０~０．４０m m o l /m o l ,２种方法测得的H b A １c 水平均符合I F C C 国际比对要求范围.
图５㊀㊀S I M 法测定H b A １c
标准曲线
图６㊀㊀M R M 法测定H b A １c 标准曲线
表２㊀㊀S I M 与M R M 模式测定样本中H b A １c 水平的
㊀㊀㊀比较(m m o l /m o l
)样本
S I M
均值
精密度(％)偏倚M R M
均值精密度(％)偏倚M e l b o r u m e ８８６．２０
１．１０－０．２０８７．００１．３３＋０．４０B e r l i n １
３２．００１．２２＋０．２０３２．２０１．７０＋０．４０C a l i f o r n i a １３１．３０１．３
５＋０．３０３０．８０１．３５－０．２０C a l i f o r n i a ８７８．５０１．８１－０．３０７９．１０１．３０＋０．３０M i l a n o ６５４．３４１．４４＋０．１４５４．１１１．６９－０．０８M i l a n o ７８８．１５１．３２－０．３５８８．６３１．１３＋０．１３M i l a n o ８７７．８０１．２５－０．２０７７．８５１．８４－０．１５M i l a n o ９
４０．４８１．１７＋０．１８４０．３９１．０３＋０．０９M i l a n o １０
４２．１５１．３８－０．３５
４２．４２１．０９－０．０８
S １３４．４９０．７７３４．５５０．８１S ２５０．５７１．４３５０．２１１．３６S ３６２．３３１．２４６２．５１１．２２S ４
８６．８５
电工高级技师论文１．６６８６．６７
１．５８３㊀讨㊀㊀论㊀㊀H b A １c 是葡萄糖与血红蛋白B 链N 末端的缬氨酸进行非酶促反应后形成的糖基化蛋白，与红细胞的
生存周期密切相关[５
]，由于其反映糖尿病患者２~３
个月前的血糖控制平均水平[６]
，一直被临床医生认可，各国研究人员也参照I F C C 推荐的参考方法开展
地区间和国际间的E Q A 计划[７]
,
由于推荐的质谱参考方法标本处理时间长，检测稳定性和重复性要求
高，也有报道对其进行改良实验[
８]
.随着三重四极杆
１３７２ 国际检验医学杂志２０１８年１１月第３９卷第２２期㊀I n t J L a bM e d ,N o v e m b e r ２０１８,V o l ．３９,N o ．２２
质谱技术的发展，通过利用相对分子质量的不同，采用多重离子对监测技术，有效地排除杂质干扰，增加专属性和灵敏度，并做出快速的分析[９].近年来该技术在分析化学领域，尤其在临床医学研究领域得到日益广泛的应用.对于复杂的㊁基质背景高的生物样本，高灵敏度和高信噪比的M R M方法受到实验室工作人员的重视，尤其对于分辨率要求高的生物样本，此前Z H A N G等[１０]也开展了应用M R M方法测定H b A１c相关内容的研究，本研究实验中发现在质谱定量分析H b A１c实验中，同时选择了二级质谱H b A０的m/z为３４８．２ң１１０,H b A１c的m/z为４２９．２ң２４５替代I F C C推荐S I M质谱法的m/z为３４８．２(H b A０)和４２９．２(H b A１c),２种模式下相关系数r２均大于０．９９，线性关系良好，测定结果也符合I F C C参考实验室国际比对的要求，由于血液样本的复杂性,M R M在抗干扰方面优于S I M，有望成为准确测定H b A１c的一种新方法.
在H b A１c测定的比对方法中[１１]，质谱法测定一直受到各界专家的认可,I F C C H b A１c标准化工作组的国际参考网络成员中,８０％的实验室采用此方法，其准确性和一致性已经过反复的论证,M R M技术在处理复杂生物样本时，具有灵敏度高，抗干扰能力强，准确度高等特点，在蛋白质测定和小分子蛋白定量检测中有着非常广阔的应用前景.
虽然本研究提示质谱M R M技术对于准确测定H b A１c有很明显的应用价值，但是由于本研究只涉及较少的实验样本，准确的循证医学研究还需要大量的后续样本的验证以便确定更准确和更优化的质谱参数[１２].
４㊀结㊀㊀论
本研究使用M R M质谱技术应用于糖化血红蛋白的检测，稳定性和重复性均符合参考方法比对要求，与I F C C推荐的S I M质谱参考方法比较干扰能力强，准确度高.
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[１２]WO N G L,L I U H,Y O N G S,e ta l．I m p r o v e dr e f e r e n c e m e a s u r e m e n tm e t h o d f o rh e m o g l o b i nA１Cb y u s eo f l i qＧu i dc h r o m a t o g r a p h yＧi s o t o p ed i l u t i o nＧt a n d e m m a s es p e cＧt r o m e t r y[J]．C l i nC h e m,２０１５,６１(２):４３５Ｇ４３６．
(收稿日期:２０１８Ｇ０５Ｇ２６㊀修回日期:２０１８Ｇ０８Ｇ０２)
２３７２ 国际检验医学杂志２０１８年１１月第３９卷第２２期㊀I n t J L a bM e d,N o v e m b e r２０１８,V o l．３９,N o．２２
