酵母双杂（Yeast two-hybrid病句题）实验操作手册和注意事项
一. 酵母双杂的原理
1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：
(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息
1. pGBKT7载体的图谱和相关信息
The pGBKT7 vector express proteins fud to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding
domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expresd at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for lection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for lection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).
b. pGADT7载体的图谱和相关信息
pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been quenced.
三．实验主要流程
A.需要准备的药品和设备
1.两种酵母菌种(AH109,Y187)
2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen ba without amino acids
Agar (for plates only)
sterile 10好莱坞性战×混乱的英文Dropout Solution
单缺-T,-L(clontech公司)
二缺-T/-L (clontech公司)
四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)
3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer
10×LiAc书信落款
40%PEG
carrier DNA
4.酵母显色所需要的药品: x-α-GAL
5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱
30℃摇床教室里的正面管教.
水浴锅
分光光度计
B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的团队管理制度分别构建。
1．纯化基因片段。
2．用相应的酶对DNA-BD载体进行酶切和纯化。
3．连接酶切片段和载体，转化到E.coli 。
4．通过内切酶分析或PCR对载体进行分析鉴定。
以上步骤基本同一般载体的构建。
C. BD自激活作用的检测。
1.把载体转化到AH109和Y187中。
把转化产物在三种培养基中生长,用空的DNA-BD载体作阴性对照。
SD/-Trp/x-ａ-Gal、
SD/-His/-Trp/x-ａ-Gal、
SD/-Ade/-Trp /x-ａ-Gal。
2.分析结果
如果转化克隆是蓝色，在SD/-His/-Trp、 SD/-Ade/-Trp 上可以生长，说明其自身激活报告基因转录，则不能用做诱饵蛋白。
D.融合蛋白毒性的测试
比较带有DNA-BD 融合蛋白载体和空的DNA-BD 载体的Y187和AH109的转化子菌系在液体培养中的生长效率。如果bait菌系生长速率要明显慢很多，则此bait蛋白可能有毒性。
在SD/-Trp上筛选，如下准备过夜培养:
挑一个较大的克隆（2-3mm）在50ml SD/-Trp/Kan（20 ug/ml）培养液中生长。30°，250-270rpm培养16-24h。
检查培养液的OD600值，它应当〉0.8。若小于，则DNA-BD fusion可能有毒性。如果没有妨碍生长，则是非毒性的，可以用来做双杂交筛选。
E.酵母的小规模转化方法
1.在1ml的YPD培养基中，接种酵母AH109(或Y187)。
2.纸盒怎么折震荡，打散细胞。
3.将细胞转移到20mlYPD中，锥形瓶的规格为250ml比较合适，较多地空气有利于酵母生长。30℃振荡培养12小时，OD600>1.6 /不大于2.0即可。
4.取合适的菌液至100mlYPD中，使OD600在0.2-0.3之间。
250rpm振荡培养3小时，直到OD600在0.4-0.6之间。
5.菌液移入50ml离心管中，室温下1000g,离心5分钟。
6.去上清，用25ml无菌水重悬细胞。
7.室温下1000g,离心5分钟。再去上清液，用1.5ml 1×TE/1×LiAc轻轻重悬细胞，制成感受态酵母菌。
8.分装感受态细胞，100μl为一管。在每管中加入0.1μg的carrier DNA和0.1μg目的质粒。轻轻混合均匀。
9.加入0.6mlPEG/LiAc，高速振荡10秒钟。
10. 30℃,250rpm摇床,摇30分钟。
11. 每管加入70μl的DMSO,轻轻的混匀,不要剧烈震荡。
12. 在42℃水浴锅中,热激15分钟。
13. 在冰上冷却1—2分钟。
14. 在室温下.14000rpm高速离心5秒,去上清液。
15. 用0.5ml的1×TE buffer悬浮细胞。
16.以适量的菌液涂平板,在30℃下,培养2-4天。
F.转化效率的计算
数出稀释平板上的克隆数目：克隆数*1000=#转化数/3ug 载体。
预期结果：〉1×106转化数/3ug 载体。
G.酵母质粒的抽提
1．细胞沉淀在250µl 抽提液中悬浮
2．加入20µl 0.45-0.55mm玻璃珠，重复悬浮震荡。
女士内裤品牌3．加入250µl 酚：氯仿，混匀。
4．15000g，离心3min。
5．取上清，加入3倍体积无水乙醇，混匀。
6．15000g，离心5min。用70%乙醇洗涤沉淀。
7．20µl无菌水溶解。
质粒抽提液：10 mM Tris-Hcl，1 mM EDTA，200 Mm NaCl，PH8.0
四.几个重要的问题的说明和一些实验中的心得体会
注意问题一: 载体的构建需要考虑到移码问题。
在酵母双杂中，所用到的蛋白都是融合蛋白，基因本身的起始密码子ATG是不起作用的,所以特别要考虑到移码问题。无论是AD-基因，还是BD-基因，都是如此。在融合蛋白之间可以有一段连接序列，但必须是三的倍数，确保目的基因在表达时不会移码。
注意问题二：酵母感受态制备的心得。
酵母感受态的制备是个很重要和精细的过程。感受态的状态不佳，极大地影响到酵转化的效率。这里有两点要注意。
a.原始菌种接种的量。
在1ml YPD培养基中，接种AH109的克隆时，大于2-3mm的大克隆，接种一个；大小在2-3mm之间的克隆，接种2-3个；小于2mm的克隆，不能用于正常的接种，重新划板活化之后再行接种。
b.酵母转接时的OD值掌握。
对数生长期的酵母菌转接到100ml的YPD中，经验量:
1.6OD600 的原菌液，取4ml左右。
2.0OD600 的原菌液，取4ml左右。
OD600 大于2.0， 原菌液就不能使用了，影响活性。
注意问题三：PEG浓度的改良。
一般经典的酵母操作手册上，在酵母转化时，用到的PEG的浓度都是40%。经过我的多次试验，40%的PEG所得到的转化效率不是最高的，35%的浓度为最好。
