细菌RNA提取
OMEGA E.Z.N.A. Bacterial RNA Kit
R6950-01
Before starting：
不容争辩
1.溶菌酶溶液与TE buffer混合至浓度15mg/ml,aliquot into 合适的 portioins，储存-20℃
2.细菌培养至log-pha
3.β-mercaptoethanol（β-ME，巯基乙醇破坏抑制核酸酶）加进buffer BRK（20ul/mlBRK）
4.用96-鸭子的英语100%的酒精dilute RNA wash buffer II(酒精：buffer2=4:1，降低盐浓度，避免影响下游反应)，储存在室温
Spin protocol：
实验前准备好：台式离心机，1.5-2ml EP管，70%酒精
法律专业毕业论文1.培养细菌至log-pha（勿过夜培养）
2.取3ml（<5x108菌体）离心，4000-5000g，4℃，5-10min
3.弃上清，用100ul lysozyme/TE buffer resuspend，用涡旋振荡器最大速混合30s
（溶菌酶的需求量取决于细菌株系，对于某些细菌，其它酶可能更有效。细胞壁完整digestion对细胞裂解影响大）
4．Incubate 10min at 30℃。在shaker-incubator中温育或每2min vortex 20s
5.在样品中加350ul buffer BRK/2-ME和25-40mg玻璃粉，vigorously vortex 5min，13000g离心5min
6.取400ul supernatant于1.5ml管，加70%酒精于lysate中，pipette混匀
7.将样品（可能已形成precipitate）加进mini colume inrted in a 2ml collection tube。离心30-60s，10000g。弃去下层液体，重利用collection tube
8.加300ul RNA wash buffer I，离心30-60s，10000g，室温。Discard flow-through
9.DNa I digestion（optional）
DNa I cat.#E1091
A.每个柱子需OBI DNa I digestion buffer 73.5ul
RNa-free DNa I（20 Kunitz/ul） 1.5ul
Total volume 75ul
轻轻吸打混匀
B. 将75ul酶液直接加到柱子最中间的resin剥皮的剥组词
C.室温（25-30℃）温育15min
Tips：在实际操作中，我们发现在膜上孵育效果并不理想，所以改到洗脱后再消化DNA，因为我们后期做的是反转录，故并不影响结果。
10.给柱子换新收集管，加窗什么几什么500ul RNA wash buffer I，离心30-60s，10000g，室温。
Discard flow-through
11. 加500ul RNA wash buffer II with ethanol，离心30-60s，10000g，室温。Discard flow-through
12. 加500ul RNA wash buffer II with ethanol，离心30-60s，10000g，室温。根绝Discard flow-through。空甩10000g，2min，室温。
13.elution of RNA。将柱子放于1.5ml EP管中（非试剂盒提供），在column matrix(基膜)中间
加30-50ul DEPC-treated water，离心1min，10000g，室温。如果希望RNA产量>30ug，进行第2次洗脱。
Tips:
1.水也用于洗脱RNA
2.2次洗脱可提高total RNA yield，但因为80%在第一次就洗脱下来会造成浓度降低。
3.水加入洗脱之前70℃预热，并在离心前室温下温育柱子5min可提高产量。
14.quantitation and storage：用spectrophotometer在260nm和280nm测absorbency。260nm下吸光度（Abs）1 O.D.单位代表40ug/mlRNA,A260/A280=2.0，核酸纯，=0.6，蛋白质纯，=1.8-2.0，核酸纯度达和服制作90-100%（不怕火phenol在275nm有最大吸收峰，影响结果，本试剂盒eliminate 苯酚的使用避免了影响）-70℃保存可达一年。
Tips: DEPC-treated water是acidic，会lower Abs260 value，所以检测前要加TE buffer（Ph=8）
若有vacuum manifold，可以用vacuum-spin column，快速抽提。
15. -80℃分管保存。细菌RNA反转录
无试剂盒，实验步骤
准备工作：用DEPC（1ml/L）水溶液处理枪头、离心管等24hr，然后高温灭菌2次，每次20min；研钵、剪刀等其他用具在180℃下烘3hr。
1、组织匀浆，在液氮中将组织研碎后，加入500μl Trizol后再充分研磨，用枪头将粉末转移到离心管中，加入500μl Trizol后用注射器抽打均匀，室温下放置5min；
2、加200μl氯仿，剧烈振荡15c，颠倒几次，室温下放置15min；
3、4℃下12,000rpm离心15min；
4、转移上清液至一新的离心管（DEPC处理）中，加500μl异丙醇，振荡混匀，室温下放置5～10min；
5、4℃下12,000rpm离心8min；
6、弃上清液，加1ml 75%乙醇，漩涡混匀（或加无水乙醇以加快挥发）；
7、4℃下7,500rpm离心5min；
8、弃乙醇，空气风干3～5min，用DEPC处理过的水（先在55～60℃水浴10～15min）溶解,根据沉淀的量，一般加入30～50μl；
9、RNA质量的检测，取1μlRNA样品稀释100倍后测定RNA浓度及OD260/280；
10、RNA保存于-80℃冰箱。
TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸
物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNa（RNA酶）。
TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。
※0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNa，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNa蛋白质中的二硫键。
