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(收稿日期：2020-08-27)
(修回日期：2020-09-10)
肝细胞内质网应激对tsRNA表达谱的
影响及其功能研究
李涵潘勤
摘要目的探讨肝细胞内质网应激相关的l RNA衍生性小RNA(l RNA derived small RNA,L s RNA)表达谱及其功能特征。方法将AML12细胞随机分为对照组和高脂组，采用棕榈酸刺激高脂组，建立肝细胞内质网应激模型。以RT-qPCR和WesLern bloL法检测内质网应激标志蛋白GRP78和CHOP的表达，油红0染色法观察脂滴生成情况。通过高通量测序技术检测LsRNA表达谱并筛选出差异基因。利用生物信息学分析预测差异LsRNA的靶基因，并通过GO分析和KEGG分析研究差异LsRNA的潜在功能。结
果与对照组比较，棕榈酸干预导致高脂组GRP78和CHOP表达在mRNA及蛋白水平均显著升高(P< 0.05)，脂肪变性显著加重。LsRNA测序得到38条差异LsRNA(倍数变化>2,P<0.05)。GO分析显示，差异LsRNA的靶基因主要调控类黄酮代谢、葡萄糖醛酸代谢和岩藻糖基化等功能o KEGG分析显示，差异LsRNA的靶基因在戊糖和葡萄糖醛酸酯的相
基金项目：国家重点研发计划项目精准医学研究专项基金资助项目(2017YFC0908903)；国家自然科学基金资助项目(81270492,81470859)作者单位：200092上海交通大学医学院附属新华医院消化内科
通讯作者：潘勤，电子信箱:
・27・
互转化、淀粉和蔗糖代谢、cAMP及Rap1等肝细胞代谢相关的信号通路中高度富集。结论内质网应激可显著改变肝细胞的LsRNA表达谱，其功能可能与调控肝脏糖代谢及生物转化作用有关。
关键词L s RNA内质网应激肝细胞生物信息学
中图分类号R575.5文献标识码A DOI10.11969/j.issn.1673-548X.2021.01.007
Expression and Function of tsRNA in Hepatocyte Endoplasmic Reticulum Stress.Li Han,Pan Qin.De
partment of Gastroenterology, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai200092,China
Abstract Objective To investigate the expression profile of l RNA derived small RNA(L s RNA)related L o endoplasmic reticulum stress(ERS)and explore Lhe functions of differentially expresd LsRNA.Methods The AML12cells were randomized inLo conLrol group and high一fat group.ERS model was established in the high一fat group with stimulation of palmitic acid.RT一qPCR and Western blot were ud to detect the mRNA and protein expression level of GRP78and CHOP,respectively.Oil red O staining was ud to test the formation of lipid drople ts.High一throughput quencing was ud to de tec t tsRNA expression profile and screen out the significantly changed tsRNAs.Bioinformatics analysis was ud to predict the target genes of differential tsRNAs.Moreover,GO analysis and KEGG analysis were conducted to explore the function of differential tsRNAs.Results Compared with the control group,the mRNA and protein expression of GRP78and CHOP were significantly incread in the high一fat group after treatment with palmitic acid.Hepatic steatosis was also significantly incread in the high一fat group.A to Lal of38differential tsRNAs were filtered out by deep quencing(fold change>2,P<0.05).GO analysis showed that target genes of tsRNA were mostly involved in flavonoid metabolic process,glucorona
te metabolic process and fucosylation.KEGG analysis showed that target genes of tsRNA were significantly enriched in signaling pathways associated with hepatocyte metabolism,such as pento and glucoronate interconversions,starch and sucro metabolism,Ras and Rap1signaling pathway.Conclusion ERS exerts great impact on the expression of hepatocellular tsRNA profile.The differential tsRNAs may function to regulate the hepatic gluco metabolism and biotransformation.
Key words tsRNA；Endoplasmic reticulum stress；Hepatocyte；Bioinformatics analysis
内质网是真核细胞内一类膜性细胞器，有脂质合成、蛋白质加工及钙离子稳态调节等重要功能。当细胞受到损伤刺激时，可发生以内质网腔内错误折叠或未折叠蛋白积聚、钙离子平衡紊乱为特征的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[1]o适度的ERS有助于内质网稳态的恢复，持续的ERS则可能诱导细胞凋亡。
近年来伴随肥胖的全球流行和生活方式的逐渐西化，以肝细胞脂肪变性、气球样变、小叶内炎症等为主要病理表现的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver dia,NAFLD)日益高发，已经成为公共卫生的重要负担有研究表明,ERS既能够诱导脂肪生成，又可参与胰岛素抵抗和自噬来驱动肝脏脂肪变性，从而在NAFLD的发生、发展过程中发挥着重要作用然而,ERS介导NAFLD的病理生理机制尚未完全阐明。
据近年来相关文献报道，应激可诱导一类tRNA 衍生性小RNA(tRNA derived small RNA,tsRNA)的产生。tsRNA是由成熟tRNA或tRNA前体经酶切产生的非编码RNA⑷。研究显示，tsRNA在肥胖症、酒精性脂肪性肝病等代谢性疾病的发病机制中发挥重要作用[5'7]O因此，本研究采用棕榈酸钠诱导肝细胞-28-脂肪变，从而建立ERS模型，以此为基础探讨tsRNA 在肝脂肪变中的表达情况及其潜在功能。
材料与方法
1.材料：小鼠肝细胞株AML12由中国科学院细胞库提供；ITS液体培养基补充剂(100x,ITS liquid media supplement)、棕榈酸(palmitic acid,PA)及油红O粉末均购自美国Simga-Aldrich公司；胎牛血清(fetal bovine rum,FBS)、DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司；RT-qPCR试剂盒购自日本TaKaRa 公司；葡萄糖调节蛋白78(gluco regulated pro- tein78,GRP7)兔单克隆抗体、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein C/EBP, CHOP)兔单克隆抗体购自美国CST公司；0-tubulin 兔单克隆抗体及山羊抗兔二抗购自上海优宁维公司；RT-qPCR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
2.细胞培养及ERS模型的建立：采用含ITS、40ng/ml地塞米松及10%FBS的DMEM/F12完全培养基，于37t、5%CO2条件下培养AML12细胞。取对数生长期的AML12细胞，随机分为对照组和高脂组，每组设3个重复。待细胞融合度达50%~60%时，高脂组给予200“mol/L PA干预24h以建立ERS
模型，对照组予不含PA的完全培养基培养24h。
3.RT-qPCR检测mRNA的表达：收集各组AML12细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，测定浓度及纯度后反转录为cDNA。然后以cDNA为模板, GAPDH为内参照进行qPCR反应，并采用2-AACt法计算GRP78、CHOP的相对表达量。GRP78的上游引物序列为：5‘-GTGTGTGAGACCAGAACCGT-3‘，下游弓I物序歹U为：5‘-TAGGTGGTCCCCAAGTCGAT—3'；CHOP的上游弓I物序歹U为:5'-CCACCACACCT-GAAAGCAGAA-3'，下游引物序列为：5'-AGGT-GAAAGGCAGGGACTCA-3'。
4.Western blot法检测蛋白的表达：收集各组AML12细胞，加入RIPA裂解液，冰上静置30min，收集裂解液，离心后取上清，用BCA法测定蛋白浓度。采用10%SDS-PAGE胶行蛋白电泳分离，并转移至PVDF膜。以5%脱脂牛奶室温封闭2h后，分别加入抗GRP78(1：1000)和CHOP(1：1000)抗体4°C孵育过夜。TBST清洗后加入二抗，室温孵育1h o采用化学发光液进行显影°以P-tubulin作为内参，分析蛋白的相对表达量。
5.油红O染色：将各组细胞以4%多聚甲醛固定30min,PBS漂洗两次，随后根据试剂盒说明书进行油红O染色°
6.tsRNA测序：收集各组细胞，以Trizol法提取总RNA，测定其浓度及纯度后采用以下步骤制备文库:①3'接头连接；②5'接头连接；③cDNA合成；④PCR 扩增庖回收0〜150bp的PCR扩增片段。使用
Agilent2100Bioanalyzer仪器检测文库质量，并根据供应商操作说明，在Illumina HiSeq4000测序仪上进行50个循环测序。
7.差异tsRNA的鉴定：使用Q30进行质控分析，保留Q30>80%的测序结果°采用Cutadapt软件(vl.9.3)去除接头和低质量reads，得到长度M16nt 的trimmed reads°依据tsRNA数据库(MINTba v2.0)的注释，统计每个tsRNA在每个样品trimmed reads中的计数，将其作为该tsRNA的原始表达量。然后使用edgeR软件(v3.16.5)计算各tsRNA的变化倍数和P值。采用倍数变化〉2.0和P<0.05为标准，筛选显著差异表达的tsRNA°
8.生物信息学分析：使用基于TargetScan(http：// )和miRanda(http:/)的miRNA靶基因预测工具，预测tsRNA在小鼠mRNA3'非翻译区的结合位点。在此基础上进行基于Geneontology()的功能分析，以及基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库(http:/www.kegg.jp/)的信号通路分析。牛蒡子的功效
9.统计学方法：采用SPSS v23.0统计学软件对数据进行统计分析。使用R语言软件(v4.0.2)绘制火山图和气泡图。数据以均数土标准差(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.肝细胞ERS模型的构建：经200^mol/L的PA干预24h后，采用RT-qPCR和Western blot法分别检测内质网应激标志物GRP78、CHOP的表达变化。结果显示，高脂组GRP78及CHOP的mRNA 和蛋白表达水平较对照组显著上调(P<0.01)，详见图1
A
□对照组
B
对照组高脂组
a对照组
图1棕榈酸诱导肝细胞ERS
A.GRP78和CHOP mRNA表达水平；
B.GRP78和CHOP蛋白表达水平
2.肝细胞ERS对脂肪变性的影响：经油红O 染色，对照组AML12细胞内未见明显的脂滴沉积，而高脂
组的细胞质内存在大量红色脂滴，详见图2。
B
图2肝细胞油红O染色(x100)
A.对照组；
B.高脂组
・29
・
3.肝细胞ERS 对tsRNA 表达谱的影响及差异 tsRNA 的靶基因预测：对高脂组（n =3）和对照组乐开
（n =3）的细胞进行tsRNA 测序，在两组中共鉴定出 193条tsRNA 。以倍数变化〉2及P <0.05为标准，
进一步筛选得到10条显著上调的tsRNA 和28条显 著下调的tsRNA，详见图3。上调的前5位tsRNA 包 括:tsRNA - Ser - AGA 、tsRNA - Met - CAT 、tsRNA -
Arg -TCG 、tsRNA - Ile - AAT 、tsRNA - Ser - GCT ；下
调的前 5 位 tsRNA 包括：tsRNA - Glu - CTC 、tsRNA - pre 一 Val 一 TAC 一 l 、tsRNA - pre 一 Val 一 TAC 一 2、tsR-
NA-Lys-CTT 、tsRNA-pre-Val-TAC -3。使用基
于TargetScan 和miRanda 的预测工具对tsRNA 作用的靶基因进行预测，共得到4973个靶基因
■下调 □无意义■上调
图3 肝细胞ERS 对tsRNA 表达谱的影响
4. 差异tsRNA 靶基因的信号通路分析：针对差
异tsRNA 的预测靶基因进行KEGG 分析。上调的差 异tsRNA 调控的靶基因在cAMP 信号通路、坏血酸和
藻酸盐代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、淀粉
和蔗糖代谢等肝细胞代谢相关的信号通路中高度富 集，详见图4。下调的差异tsRNA 的靶基因则主要富 集于Rap1信号通路、Ras 信号通路、VEGF 信号通路、 甘油磷脂代谢等信号通路，详见图5。
5. 差异tsRNA 预测靶基因的功能分析：针对差
异tsRNA 的预测靶基因进行GO 分析，并列出前10 位的功能富集类别，详见表1。可见上调的差异tsR NA 所调控的靶基因主要干预类黄酮代谢、细胞葡萄 糖醛酸化、葡萄糖醛酸代谢、糖醛酸代谢等生物学过
程。而下调的差异tsRNA 所调控的靶基因主要影响
基因数
qq邮箱的正确写法• 10• 20
• 30
公鸡用英语怎么说
E 0.0012I 0.0009
| 0.0006| 0.0003
图4上调的差异tsRNA 靶基因的KEGG 分析
6x10」4x10-52x10-5
Ras 信号通路-Rapl 信号通路-
癌症通路-胰腺癌-非小细胞型肺癌・甘油磷脂代谢-
胞吞作用-趋化因子信号通路-
轴突导向-
VEGF 信号通路-
一毫米
P
丰度值
图5下调的差异tsRNA 靶基因的KEGG 分析
基因数
• 40• 60• 80• 100
肝细胞的代谢功能，如细胞对固醇耗竭的反应、岩藻 糖基化等。
讨 论
tsRNA 作为新兴的非编码RNA，其异常表达已在 多种疾病中得到证实，并通过调节生物过程和基因表
达发挥重要作用［8］。本研究通过测序，发现ERS 能
够导致5. 2%的肝细胞tsRNA 显著上调，而14. 5% tsRNA 显著下调。在高度差异表达（倍数变化〉3）的
tsRNA 中，上调和下调tsRNA 的数量分别为2条和
11条，提示ERS 主要抑制肝细胞tsRNA 的表达。业
・30
・
表1肝细胞ERS相关差异tsRNA靶基因的GO功能分析
GO：生物学过程富集倍数P
上调tsRNA的靶基因
GO：0009812类黄酮代谢过程9.15 2.0x10-6 GO：0052695细胞葡萄糖醛酸化过程7.749.2x10-6 GO：0019585葡萄糖醛酸代谢过程7.19 1.7x10-5 GO：0006063糖醛酸代谢过程7.19 1.7x10-5 GO：0010454细胞命运的负性调控 6.29 5.1x10-5 GO：0014745肌肉适应的负性调控 5.998.5x10-4 GO：0032488Cdc42蛋白信号转导 5.998.5x10-4 GO：2000253摄食行为的正性调控 5.998.5x10-4 GO：0010612心肌适应性调控 5.75 3.5x10-3 GO：0022027细胞核动态迁移 5.75 3.5x10-3
下调t sRNA的靶基因
GO：0006991固醇耗竭反应 4.05 3.4x10-4 GO：0071501细胞对固醇耗竭的反应 4.05 3.4x10-4 GO：0036065岩藻糖基化 3.75 1.8x10-5 GO：0009812类黄酮代谢过程 3.687.9x10-4 GO：0010807突触囊泡启动调控 3.687.9x10-4 GO：0016188突出囊泡成熟 3.687.9x10-4 GO：0070213蛋白质自动ADP核糖基化 3.687.9x10-4 GO：1903867胚外膜发育 3.687.9x10-4 GO：0003177肺动脉瓣发育 3.58 6.1x10-6 GO：0019054病毒宿主调控过程 3.56 4.4x10-4
已证实,tsRNA具有与miRNA相似的功能，可能与特定靶基因的mRNA结合并使其直接降解或抑制其转录后翻译，提示tsRNA可通过类miRNA样作用调控下游靶基因，进而发挥生物学功能[9]。
笔者联合使用基于TargetScan和miRanda的预测工具来预测ERS相关差异tsRNA的靶基因。结果发现，上调tsRNA的靶基因显著富集于抗坏血酸和藻酸盐代谢、淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化等碳水化合物代谢途径。目前研究表明，酒精性脂肪性肝病可导致淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化等糖代谢通路发生显著改变[10]。Zhong等[6]研究发现，以Gly-tRF为代表的tsRNA 参与了补体C3激活所致的肝脂肪变性。因此，笔者推测肝细胞在ERS条件下可通过上调tsRNA表达，抑制糖代谢相关基因的表达。
此外，下调tsRNA的靶基因显著富集于Rap1及Ras信号通路，表明ERS诱导的tsRNA下调可能增强Rap1及Ras信号通路活性。Rap1是Ras超家族的一个小G蛋白，参与细胞黏附和运动、细胞增殖、血
管生成和细胞骨架重塑等多种生理过程["打在Ras 信号通路中,Ras参与细胞增殖、分化和细胞周期等细胞过程的调控["]。两者可能通过影响细胞骨架，参与上皮间质转换(epithelial-to-menchymal transition,EMT)[13]o EMT则与细胞代谢重编程密切相关，可能导致糖酵解增强，脂肪生成增强和分解下降，从而系统影响肝细胞的代谢表型[14'15]O
在GO功能分析中，笔者发现上调的tsRNA靶基因主要涉及类黄酮代谢过程、葡萄糖醛酸代谢过程及糖醛酸代谢过程。多种类黄酮均具有对抗细胞氧化应激和调节脂质代谢的作用。Zheng等[16]研究发现，黄苓苷可通过抑制ERS和TXNIP/NLRP3炎性体的激活，保护AML12细胞免于PA诱导的脂毒性损伤。结合笔者的研究结果，提示tsRNA表达上调可能通过抑制类黄酮代谢功能加剧ERS介导的细胞损伤。另外，糖醛酸途径的中间产物—
—尿苷二磷酸葡糖醛酸是重要的解毒物质，并在肝内生物转化过程参与多种结合反应。上调的tsRNA可能抑制葡萄糖醛酸代谢及糖醛酸代谢等肝脏生物转化过程，影响肝脏解毒功能，从而导致肝细胞受损。
在下调tsRNA的靶基因功能分析中，笔者发现靶基因主要涉及岩藻糖基化过程。岩藻糖基化是肝病中最常见的聚糖改变之一，有研究证实IgG的岩藻糖基化水平与NAFLD呈正相关，并且岩藻糖基化与细胞EMT过程密切相关[17'18]O这些研究结果提示, ERS介导的tsRNA下调可能通过促进细胞岩藻糖基化过程参与NAFLD的发生、发展。
综上所述，脂肪酸刺激诱导的ERS可显著改变肝细胞tsRNA表达谱。差异表达的tsRNA通过调控与碳水化合物代谢、EMT相关的信号通路，可能影响肝细胞的糖代谢、氧化应激和生物转化等功能。这些发现提出了一种肝细胞ERS参与NAFLD的新型病理生理机制，有望为NAFLD的诊断和治疗提供全新思路。但tsRNA的确切作用仍有待更深入的体内外研究加以阐释。
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