DOI：10.3969/j.issn.1674-2591.2020.06.011
•综述・
电镜技术在骨质疏松研究中的应用
黄觅1，王瑛2，魏孝义2，彭锐1
［摘要］骨质疏松症是一种以骨量减低、骨微结构破坏为主的隐匿性疾病，已成为严重影响中老年人群健康的慢病之一。电子显微镜(electron microscopy,EM)以其高精密度优势逐渐应用于医学科研及临床诊断。本文对近年来电镜技术在骨质疏松科研领域的应用与进展进行综述，介绍EM技术在骨质疏松研究领域中的应用，包括动物模型、细胞模型、临床研究、生物材料研究以及免疫电镜的应用。展望EM技术在骨质疏松研究领域的应用拓展及普及。
［关键词］骨质疏松；电子显微镜；动物模型
中图分类号：R681文献标志码：A
Application of electron microscope in osteoporosis rearch
HUANG Mi,WANG Ying2,WEI Xiao-yi2,PENG Rui
1.Hubei University of Chine Medicine,Wuhan430000,China；
2.Key Laboratory of South China Agricultural
Plant Molecular Analysis and Genetic Improvement,Provincial Key Laboratory of Applied Botany,
South China Botanical Garden,Chine Academy of Sciences,Guangzhou,510650,China [Abstract]Osteoporosis is an insidious dia mainly characterized by decread bone mass and destruction of bone microstructure.It has become one of the worst chronic dias that riously affect the health of middle-aged and old people.Electron microscope(EM)with its high precision advantage gradually applied to medical rearch and clinical diagnosis.In this paper，the application and progress of EM technique were reviewed in the field of osteoporosis rearch in recent years，and the application of EM technique in the field of osteoporosis rearch was introduced，including animal model，cell model，clinical rearch，biomaterials rearch，and immunoelectron microscopy.It is expected that EM technology will be widely ud in osteoporosis rearch.
[Key words]osteoporosis；electron microscopy；animal model
随着科技的发展和我国老龄化社会的到来，骨质疏松症(osteoporosis,OP)已成为严重影响中老年人群
健康的慢病之一。它是一种以骨量减低、骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病［1］。目前临床上主要依据骨质疏松指南推荐的以定量超声(quantitative ultrasound system,QUS)或指骨放射吸收法(radiographic absorptiometry,RA)进行骨质疏松风
基金项目：中国科学院华南农业植物分子分析与遗传改良重点实验室开放课题(KF202002)；湖北省自然科学基金(2018CFB695)
作者单位：1.430061武汉，湖北中医药大学针灸骨伤学院；2.510650广州，中国科学院华南农业植物分子分析与遗传改良重点实验室，广东省应用植物学重点实验室，中国科学院华南植物园
通信作者：彭锐，E-mail:
险初筛，双能X线吸收检测法(dual energy X-ray absorptiometry,DXA)或定量CT(quantitative computed tomography,QCT)检查明确诊断⑵。但以上的检测方式各有其局限性，无法准确的反映骨强度、骨微结构以及细胞病理等微观变化。因此，电子显微镜(electron microscopy,EM)在骨质疏松基础研究方面的应用越来越广泛。本文将对EM在OP领域的相关临床及基础研究方面的应用进行综述。
EM技术概述
EM技术是20世纪重大发明之一。Ruska和Knowll在20世纪30年代初成功研制出第一台EM，使科学家
们能看清0.5nm的微观结构，其放大倍数达十万倍以上［3］。随着计算机技术的发展，EM技术和功能也日益进步，放大倍数已超过1000多万倍，并在生物、医学等领域得到广泛应用。
EM主要由镜筒、真空装置和电源柜三部分组成。其主要分为透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)两大类。SEM主要用于研究固体表面形貌特征，并得到固体表面的三维效果图像。TEM常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；SEM主要用于观察固体表面的形貌特征，也能与X射线衍射仪或电子能谱仪相结合，构成电子微探针，得到固体表面的三维效果图像，用于物质成分分析，从而获取样品本身的物理、化学性质等信息。另外，电子束与样品作用能激发出特征X射线、阴极荧光、俄歇电子等有价值的信号，可应用于原位元素分析［4］。
EM技术以其高精密度优势广泛应用于医学临床病例诊断，并且在实践中不断为病理学“开疆辟域”，例如利用EM观察亚细胞机构及病原体，不仅可以快速、精确诊断诸多病毒和寄生虫疾病以及肿瘤疾病等，还可以进一步丰富和健全传统病理学理论体系知识，并逐渐形成病理研究遂由组织细胞水平推进至亚细胞水平，进而研讨疾病的发生与发展规律的超微病理学的学科。可以说，EM的出现直接将生物医学研究、生物病理学研究从宏观水平推入微观水平。
EM技术在骨质疏松动物模型中的应用
动物模型
骨质疏松动物模型中，最常用的是大鼠、小鼠、犬、兔、羊及灵长类动物等。由于兔、小鼠、大鼠具有繁殖能力强，成本低，造模稳定和重复性好等优势，其商品化抗体种类丰富，现代基因技术应用前景广阔，并逐渐成为OP造模的主要方式。近年来，斑马鱼的OP动物模型也日趋成熟，被逐渐运用于OP的研究中［5-6］。
大鼠模型：大鼠的骨代谢与人有许多相似之处，大鼠的骨松质分布、重建功能、去卵巢后的高转化率、肠钙吸收功能下降及对激素的反应性都与人体类似。由于大鼠的体积相对较大，去势OP模型造模相对稳定。因此，大鼠目前仍然是研究OP最常见、最成熟的模型动物。朱晓姝等［7］在对去卵巢大鼠的研究中发现，OP可能导致拔牙后的去卵巢大鼠骨愈合时间延迟，而雌激素的治疗能明显缩短拔牙后骨愈合的时间。通过EM观察可以发现，模型大鼠30d，新生的板层样骨中存在大量的骨吸收陷窝，而雌激素组的新骨形成致密，吸收陷窝较少。余萍萍等［8］在建立大鼠去卵巢模型中，利用SEM观察到去卵巢大鼠胫骨平台松质骨区域，骨小梁疏松，局部塌陷，钙盐颗粒散在分布，胶原纤维较多，而皮质骨无明显变化。李亚然等⑼在对去卵巢雌性大鼠OP 模型中，用牛骨肽和生理盐水分别灌胃，发现在11周时药物组与对照组相比，SEM下的骨小梁更光滑、排列致密、连续性好、容积更高。Jeong 等［10］利用大鼠OP模型，观察股骨干内侧皮质表面，寻找骨细胞小管、骨纤维和表面粗糙程度等微观结构差异。江大雷等［11］在中药骨疏灵和运动联合应用对去势大鼠模型骨量丢失的抑制
作用研究中，在EM下观察到实验组的骨小梁结构趋于正常，抑制骨量丢失作用明显。王立童等［12］也观察到密骨胶囊和健脾方有显著的维持去卵巢大鼠的骨密度作用，EM下的药物组骨小梁三维结构基本完整，与假手术组接近。
除此之外，其他不同的造模方式也同样适用于EM观察研究。通过定量比较发现老龄大鼠和OP大鼠的骨小梁表面更为粗糙。SEM对骨小梁的观察对比，则是常用的实验室检测方法。裴玉岩等［13］在研究淫羊藿对OP大鼠下颌骨骨量变化的影响中，应用SEM观察骨小梁的宽度，对照组与药物组在骨小梁排列、洞壁的光滑程度、骨吸收、骨质是否中断等方面存在显著的差异。而王兵等［14］也通过观察EM下糖尿病OP大鼠胫骨骨胶原重塑的改变，证实肾消康可有效促进骨胶原组织的再生和重塑，为OP的防治提供了另一个思路和方法。
在大鼠模型中，EM比较容易观察到如骨吸收陷窝的改变、骨小梁的排列及胶原纤维结构变化等。但由于大鼠皮质重建活性较低，不宜用于评价药物对哈弗氏系统的重建作用。因此，在选取EM扫描区域时，建议以松质骨为主。
小鼠模型：由于小鼠的基因组和人类有较高的相似性，因此小鼠模型在骨代谢和遗传因素的相关研究中应用广泛。通过对目的基因进行敲除或者导入，观察其表型特征及其病理改变。Shu 等［15］通过对SOST基因的抑制从而加强内植物的稳定，在SEM下观察证实内植物表面的粗糙程度增加明显，为
临床上提高OP患者内固定手术的植骨融合率提供了新的策略。Rangel等［16］对去势小鼠的矿物代谢和骨超微结构进行了研究，SEM 图像显示维生素K有效的改善了 OP小鼠的微骨折。
由于小鼠体积较小，其标本的取材及制作上相对困难，在早期的OP基础研究中的应用受到了一定的限制。随着实验器材及技术的进步，其适应性及抗病性强，品系多，成本低等优势显现。特别是快速老化模型小鼠(nescence accelerated mou prone6,SAMP6)，是目前仅有的一种能证明增龄性骨脆性骨折的自发老年性OP模型。Chen等［17］在对比快速衰老模型小鼠SAMP6与正常小鼠(nescence accelerated mou-resistance1, SAMR1)后发现，EM下5~8月后SAMP6小鼠的骨骼肌、肌腱和骨膜形态出现显著的退变。Mirsaidi等［18］在SAMP6小鼠体内注射分离的脂肪衍生基质细胞，6周后可显著改善骨小梁质量。
通过EM直接对骨组织进行观察可以直接反映骨结构的微观改变，而中医药科研人员，充分发挥中医药抗骨质疏松的理论优势，不仅仅EM 下对骨组织相关结构进行观察对比，他们还通过对其他组织器官的微观扫描观察，结合中医理论与OP研究建立联系。刘立萍等［19］通过SEM对SAMP6小鼠(快速老化小鼠)的肠绒毛紧密连接破坏及线粒体肿胀情况进行观察，并对照Micr。-CT结果。左归丸及左归丸合苓桂术甘汤可能通过肠黏膜屏障结构和功能保护调节免疫功能，阻止骨结构破坏，防治老年性OP，为其研究提供了一个新的切入点。
兔模型：与大鼠模型相比，成年兔具有强大的哈弗氏系统重建能力，骨骼在6个月即可发育成熟，骨骺线闭合，因此，在骨发育和重建中比鼠更具优势。可以用于促骨合成代谢的药物对骨松质及哈氏重建作用的研究。此外，兔模型还可以作为糖皮质激素诱导的OP模型。杨晋等［20］应用去势加肌肉注射氢化可的松的方法建立兔OP 模型，在EM下观察股骨头的骨小梁结构、骨髓腔、骨陷窝及骨组织，发现模型组组骨小梁明显稀疏变细、结构紊乱、断裂严重、空骨陷窝明显增多。证明该兔模型可成功建立并可缩短OP造模时间。Xie等［21］通过SEM评价结合了淫羊藿苷的生物支架体系，并将其植入OP兔模型体内观察其生物相容性和促成骨作用，证明其在骨科应用中的潜力。因此，兔模型结合EM在生物材料的应用、哈弗氏系统的研究等方面具备一定的优势。
斑马鱼模型：斑马鱼因其与哺乳动物基因的高度同源性，近年来逐渐成为药效及毒性作用筛选的热门模型。中草药研究在传统的实验模式中，通常耗时长、费用高、实验强度大，而斑马鱼模型在短时间内进行大量微量成分的筛选及评价方面优势明显⑷。向湘等［22］利用光学相干层析技术对斑马鱼OP模型进行活体成像，并结合EM能谱技术定量分析斑马鱼模型骨质的钙磷元素含量及分布情况，发现在20d时，模型组骨质内的钙磷含量大幅度下降。通过对活体的斑马鱼颅骨的
秋霞瓜皮中风的原因成像监测，发现其在药物筛选及骨骼发育等研究方面，具有广阔的应用前景和先天优势。该成年斑马鱼0P模型的建立，为研究0P的发病机制、药物筛选以及更多的防治方法提供了新的方法和思路。
细胞模型美国糼交
0P研究中，成骨细胞和破骨细胞在骨质形成与代谢过程中发挥了主要作用。因此在0P的研究中，成、破骨细胞的研究也占据主导。而EM技术的发展，为细胞层面的分子机制研究提供了更直观的形态学依据。将绝经后0P大鼠的骨髓基质细胞进行分离培养，构建细胞膜片。在TEM下观察细胞、细胞外基质及细胞间连接。观察到其膜片系统能够稳定的构建多层的细胞外基质，具有良好的弹性及机械功能⑺］。在体外培养的破骨细胞模型中分别加入白细胞介素-6(inter-leukin-6,IL-6)和骨保护素，利用SEM观察骨片中的吸收陷窝，可观察到其对破骨细胞功能的抑制作用［24］。
EM技术在临床研究中的应用
临床上将0P定义为是以骨量减低、骨微结构退变、易发生骨折为特征的一种全身性骨骼疾病。而在0P的实验研究中，利用EM对实验标本的微结构及功能基团进行观测，可以直观的了解各种病理状态下的表现，有利于进一步的机制研究。由于伦理学及有创操作等因素的限制，在临床上较少单纯针对0P进行骨组织活检，当0P 伴发骨折或股骨头坏死等临床疾病需要手术治疗时，可同时进行骨组织活检，EM下可以直观的评估该患者的骨微观结构变化。徐丛等［25］通过人股骨头标本观察绝经后女性不同Singh指数股骨头骨小梁结构及EM下骨超微结构情况，发现6级分法并不能准确的反映出骨超微结构的变化。段浩等［26］通过EM对人股骨头的骨表面围观形态进行观察，通过软件提取形貌参数，发现其微观形貌会随骨状态的不同而改变。其矿化胶原纤维束的直径、长度、去向分布均不同。而Gul等［27］对14例低能量损伤导致股骨颈骨折的患者进行研究，术中取出关节置换部位股骨颈组织
豆乳盒子标本，并进行TEM及评估，发现0P患者除骨量减少和皮质骨厚度有明显差异外，其哈佛氏系统的退变、松质骨骨小梁的宽度等微观结构的表现无明显差异。俞华威等［28］将0P骨折部位的组织进行不同倍数下的EM扫描，观察骨小梁的结构、骨陷窝及骨细胞的数量以及骨小梁结构变化，并与患者碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等骨标志物的指标进行对比，分析其病理病机，为临床用药提供指导和依据，具有一定的临床推广价值。
0P已成为我国乃至全球慢性疾病的第三位，发病率随年龄增高而增长［29-30］o然而，现有的诊断标准及治疗评价方案均无法客观的反映微观组织的变化情况。在椎体成形、骨组织活检等微创介入手术的临床应用中，可收集大量组织标本［31］。可以结合EM技术，建立标本库，进而利用大数据评价骨组织的微观变化，从而为临床抗OP治疗提供更准确的评估手段。随着这种直接对临床患者的骨组织进行的EM诊断技术的应用，将对今后的临床诊疗及科研具有积极的指导意义。
EM技术在生物材料研究中的应用
现代EM的推广与应用，极大地推进了科学进步。尤其在生物纳米材料研究领域，EM更是重要的分析与表征工具，可应用于指导新颖纳米结构的构建、揭示材料与细胞/组织相互作用并发挥功能的机制［32］O
钛合金材料在骨重建中应用广泛，随着我国人群的高龄化，0P伴发的骨关节严重退变，接受关节置换
的患者呈逐年上升趋势。如何提高钛合金假体在关节置换后周围骨性结构的长入率，一直是临床及材料学研究的热点。Lai等［33］将壳聚糖、明胶和辛伐他汀等材料结合自旋辅助逐层技术制备多层膜结构修饰钛合金材料，并利用TEM观察材料表面细胞增值及矿化等改变。除此之外，还可以利用相似的方式观察钛合金混合多层涂层，了解不同的涂层在0P条件下对钛合金植入物的骨重建增强效果［34］。
羟基磷灰石是常用的替代性骨修复材料。研究表明，将其修饰形成氟化羟基磷灰石后，在SEM下看到多孔的氟化羟基磷灰石，利用能量色
散谱分析可测定氟元素含量。结合其他实验结果即可证实，氟化羟基磷灰石具有抑制破骨细胞增值分化、促进凋亡以及减少骨吸收等作用[旳。
EM还可以在细胞或亚细胞结构水平表征细胞或组织对纳米材料的识别、吞噬，以及材料进入胞浆后的转运、药物释放与降解过程，用于精确评价生物安全性并验证预设的治疗效果[旳。Marycz等[37]利用SEM对其铁氧化物纳米颗粒进行结构性能分析，证实其具有同时调节破骨细胞和成骨细胞活性的作用。运用EM进行骨组织与生物材料结构及性能分析的方法，是研究骨质疏松与生物材料有效性的重要手段。
OP与免疫电镜
免疫电镜技术(immunoelectron microscopy, IEM)又称为免疫细胞化学技术。该技术是利用抗原与抗体特异性结合的原理，可精确定位各种抗原的存在部位。在超微结构水平上研究细胞结构与功能的关系，以及在病理情况下所发生的变化。主要步骤有：抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析等。
学生会生活部在离体的人破骨细胞培养中，可将目标蛋白进行标记，运用IEM观察电压依赖性阴离子通道的不同时期，人破骨细胞线粒体质膜中的分布情况。同时，用全细胞膜片钳技术分别记录单核细胞、破骨细胞前体和破骨细胞的跨膜阴离子电流变化情况；并用免疫荧光标记膜蛋白位置及其表达。从而系统阐述电压依赖性阴离子通道与人破骨细胞的分化和功能相关性[38]。还可以通过分子生物学技术及IEM技术，对G蛋白复合物进行标记后，利用EM观察到接近原子分辨率的图像，阐述了B类G蛋白偶联受体一降钙素受体的功能及作用机制[3刃。IEM的应用，在研发抗骨质疏松靶向药物及研究药物作用机制等方面和提供了重要的研究方法。
小慈姑
总之，随着社会与科技的发展，人类医学也从各个学科和技术领域实现了跨越式发展，而当代的显微镜技术的革新也为现代医学揭开了无数的谜团，随着EM在医学领域特别是骨质疏松研究领域的广泛应用，其高精密度的特点为临床病例的诊断和实验技术的革新发挥了重要的作用。
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