illuminaSBS测序详解中国古代兵器
最近回头重新看了illlumina paired end quence的测序原理视频，发现了以前没有注意的⼀些问题，⽽这些问题也是⼤家平时容易搞错的，因此花了⼏天时间将illumina 的paired end quence 从构建⽂库到上机测序的整个过程以及原理较为详细的写了出来。
基础知识：illumina测序的核⼼在于利⽤可逆终⽌的、荧光标记的dNTP进⾏边合成边测序
Flowcell（流动池）是有着2个或8个lane（泳道）的玻璃板，。每个lane可以测⼀个样本或者多样本的混合物，且随机布满了能够与⽂库两端接头分别互补配对或⼀致的寡核苷酸（oligos，P7和P5接头）。⼀个lane包含两列，每⼀列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在⼀次循环中会拍照4次（每个碱基⼀次）。
paried-end quencing
⼀、Library Preparation⽂库的构建
1. 利⽤转座⼦（transposome）对双链DNA进⾏剪切以及接头（adapter）的连接
2. 接头连接成功后，利⽤低循环扩增技术在接头处进⾏修饰，分别在两端添加quencing primer bindin
g site1/quencing primer binding site2（即测序引物结合位点）、index1/index2以及我们称之P5和P7的寡核苷酸序列
上图并没有将之前的adapter标志出来，下图是维基百科的⽰意图，详细⼀些。
这⾥要注意两点（1）P5和P7是不同的，它们分别和flowcell上的接头互补和相同。为了⽅便阐述，将与P5互补的接头称为P5’，与P7互补的接头称为P7’。（2）index1和index2也是不同的，与P5相连的是index2，与P7相连的是index1。
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关于index，也叫barcodes，因为⼀个lane可以同时测多个样品，为了避免混淆样品的read products，每种样品的DNA由⼀种index修饰，这样测序得到的reads都是具有index标记的，在测序结果中，依据之前标签与样品的对应关系，就可以获得对应样品的数据。⽽这⾥的index1和index2是为了区分paired-end测序得到的双端reads。
⼆、Cluster generation 簇⽣成
1. Flowcell上随机分布了两种不同的寡核苷酸序列，分别与P5互补（即P5’），与P7⼀致（即P7）。
2. 待测quence通过P5与folwcell上的P5’序列杂交互补，以待测quence为模板进⾏互补链（即rever strand）的延伸，互补链的两端为P5’和P7’。
肥胖的原因3. 接下来模板链被切断并洗下
勤俭节约小故事Rever strand的P7’与Flowcell上的P7杂交互补，进⾏链的合成，这就是我们所熟知的桥式PCR
接下来合成的双链被解链，再分别与Flowcell上的接头杂交互补，延伸....解链，杂交，延伸，解链...如此重复35个循环
4. 桥式PCR完成后，使⽤NAOH将双链解链，并利⽤甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）对8-氧鸟嘌呤糖苷（8-oxo-G）的选择性切断作⽤，选择性地将P5’与链的连接切断，留下与Flowcell上P7连接的链，也就是Forward strand。同时游离的3’端被阻断，防⽌不必要的DNA延伸
三、测序
1. 测序引物（quencing primer）结合到靠近P5的测序引物结合位点1（quencing primer binding site 1）上，在系统中加⼊四种dNTP和DNA聚合酶。这⾥的dNTP有两个特点：它是有荧光基团标记的，每种碱基标记的荧光基团不⼀样。它的3’末端连了⼀个叠氮基。这个叠氮基能够阻断后⾯的碱基与它相连
因此在聚合酶的作⽤下，与Forward strand相应位置碱基配对的dNTP就会结合到新合成的链上，⽽由于叠氮基的存在，后⾯的dNTP⽆法继续连接。这时⽤⽔将剩余的dNTP和酶给冲掉，将Flowcell进⾏
扫描，扫描出来的荧光对应的碱基的配对碱基即是该链该位置的碱基。同时在这个Flowcell上有成千上万个cluster也在进⾏同样的反应，因此⼀个循环就能同时检测多个样本（这也是⾼通量的核⼼所在）。这个循环完成后，加⼊化学试剂把叠氮基和标记的荧光基团切掉，进⾏下⼀个循环（碱基的连接、检测与切除）。如此重复直⾄所有链的碱基序列被检测出。也就是Forward read 序列。
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2. Index测序：所有循环结束后，read products 被洗掉，index1 primer与链上index primer1 结合位点杂交配对，进⾏index1的合成及检测
3. Index1测序完成后，洗脱测序产物。此时机器已通过荧光得到了index1的序列
古诗草4.Index2测序：Forward strand顶端的P5序列与Flowcell上的P5’杂交配对，进⾏index2测序。测序完成后洗脱产物
四、Paried-end quencing（即对Rever strand测序）
1. 洗脱index2测序产物后，以Flowcell上的P5’为引物，Forward strand为模板进⾏桥式扩增，得到双链
2. NAOH使双链变性为单链，并洗去已经测序完成的Forward strand
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利息英文3. 类似的，readprimer2结合到靠近P7’的read primer binding site 2开始对Rever strand的测序。测序完成后即可得到Rever read序列。
总结：有两点需要重点注意：（1）DNA⽚段连接的两个接头P5和P7，它们与Flowcell上的两种寡核苷酸序列分别互补和相同，并不是都相同
（2）结合在DNA⽚段两端的index序列也不同，分别是index1和index2
前⾯介绍的都是paired-end的测序，⽽single-end测序⽅式是只将index，quencing primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA⽚段的⼀端，另⼀端直接连上P5/P7，将⽚段固定在Flowcell上桥式PCR⽣成DNA簇，然后单端测序读取序列
最后给出illumina的官⽅视频
/v_show/id_XMTI1MjA5Mzg5Mg==.html?
spm=a2h0k.8191407.0.0&from=s1.8-1-1.2
