3660 ｜中国组织工程研究｜第25卷｜第23期｜2021年8月
七氟醚联合氙气预处理对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用
范军朝，陈 勇，宋俊杰
文题释义：
脊髓缺血再灌注损伤：脊髓缺血后恢复灌注造成的氧化应激损伤，临床中常见于胸腹主动脉手术的严重并发症之一，可造成脊髓神经细胞延迟性死亡，严重者导致永久性瘫痪或死亡。
氙气：一种惰性气体，由于其化学性质稳定常用于射线检查时的物理防护，也是一种几乎无副反应的吸入型麻醉剂。有研究显示其具有一定心肌组织及神经组织保护作用。
摘要
背景：脊髓缺血再灌注损伤是一种严重的神经组织损伤，七氟醚及氙气均被报道对脏器缺血再灌注损伤有一定保护作用，但二者联合是否可以缓解脊髓组织损伤目前仍不明确。
目的：探讨七氟醚联合氙气预处理保护大鼠脊髓缺血再灌注损伤的疗效及其机制。
方法：60只SD 大鼠随机分为假手术组、脊髓缺血再灌注组、七氟醚组、氙气组、七氟醚联合氙气组、七氟醚联合氙气+PI3K 抑制剂LY294002组(SXI+LY 组)，每组10只。其中假手术组行假手术，七氟醚组、氙气组、七氟醚联合氙气组及SXI+LY 组分别进行3.4%七氟醚、50%氙气、七氟醚联合氙气、七氟醚联合氙气+LY294002预处理，并行脊髓缺血再灌注损伤建模手术。比较各组大鼠的BBB 后肢运动功能评分，尼氏染色和TUNEL 染色观察脊髓组织中正常神经元和前角细胞的凋亡情况，Western Blot 检测脊髓组织中PI3K 、AKT 和磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-respon element binding protein ，CREB)的表达及其磷酸化情况。
结果与结论：①七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组大鼠BBB 后肢运动功能评分均高于脊髓缺血再灌注组，七氟醚联合氙气组的BBB 后肢运动功能评分高于七氟醚组和氙气组，而SXI+LY 组的BBB 后肢运动功能评分低于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P 均<0.001)；②再灌注24 h 后，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组前角细胞凋亡指数低于脊髓缺血再灌注组，七氟醚联合氙气组低于七氟醚组和氙气组；SXI+LY 组高于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P 均<0.001)；③与脊髓缺血再灌注相比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组脊髓组织中p-PI3K 、p-AKT 和p-CREB 的表达均升高，其中七氟醚联合氙气组的表达最高，而SXI+LY 组低于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P 均<0.001)；④提示七氟醚联合氙气预处理较单一应用对脊髓缺血再灌注损伤有更好的保护作用，其作用机制可能与对PI3K/AKT/CREB 信号通路的影响有关。
关键词：七氟醚；氙气；脊髓；缺血再灌注损伤；PI3K/AKT/CREB 信号通路；预处理缩略语：磷腺苷效应元件结合蛋白：cAMP-respon element binding protein ，CREB
Sevoflurance combined with xenon pretreatment protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in a rat model
Fan Junchao, Chen Yong, Song Junjie
Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, Henan Province, China
Fan Junchao, Master, Associate chief physician, Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, Henan Province, China /10.12307/2021.036投稿日期：2020-07-13 送审日期：2020-07-15采用日期：2020-08-15 在线日期：2021-01-05中图分类号： R459.9；R318；R651.2文章编号：
2095-4344(2021)23-03660-06文献标识码：B
河南大学第一附属医院麻醉科，河南省开封市 475001
第一作者：范军朝，男，1980年生，河南省汝州市人，2017年河南大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事麻醉与脏器保护方面的研究。通讯作者：宋俊杰，硕士，主治医师，河南大学第一附属医院麻醉科，河南省开封市 475001 /0000-0002-1478-3283 (范军朝)
基金资助：河南省教育厅科学技术研究重点项目 (19A320021) ，项目负责人：宋俊杰
引用本文：范军朝，陈勇，宋俊杰. 七氟醚联合氙气预处理对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用[J].中国组织工程研究，2021，25(23):3660-3665.
研究原著
动物分组：(1)假手术组；(2)脊髓缺血再灌注组；(3)七氟醚组；(4)氙气组；
(5)七氟醚联合氙气组；(6)七氟醚联合氙气+PI3K 抑制剂LY294002组。
观察指标：
(1)BBB 后肢运动功能评分；(2)观察脊髓组织中正常神经元和前角细胞的凋亡情况(尼氏染色和TUNEL 染色)；(3)脊髓组织中PI3K 、AKT 和磷腺苷效应元件结合蛋白的表达及其磷酸化情况(Western Blot)。
结论：七氟醚联合氙气预处理对脊髓缺血再灌注损伤有更好的保护作用。
造模及干预
0 引言 Introduction
脊髓缺血再灌注损伤是胸腹主动脉手术中常见的并发症之一[1]，能够引起脊髓神经细胞延迟性死亡，导致患者永久性瘫痪甚至死亡，严重影响患者的生活质量。目前，已有大量研究证实一些麻醉药物可以通过抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种机制，在一定程度上减轻脊髓缺血再灌注损伤，促进受损的脊髓功能恢复，预防损伤进一步加重[2]。七氟醚是临床上广泛应用的吸入型麻醉剂，在动物和临床研究中均发现，七氟醚预处理能够有效减轻器官缺血再灌注损伤及神经认知功能障碍[3-5]。氙气是一种化学性质稳定的麻醉气体，多数研究认为其具有心肌保护和神经保护作用[6-8]。有研究发现七氟醚预处理或氙气后处理在一定程度上均能够减轻脊髓缺血再灌注损伤[9-10]，但是七氟醚联合氙气预处理是否
能够更为有效地减轻脊髓缺血再灌注损伤尚不清楚，且其神经保护作用机制还有待深入探究。此次研究拟观察七氟醚联合氙气预处理大鼠脊髓缺血再灌注损伤的效果，并探讨其作用机制。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2019年11至12月在河南大学基础医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物成年雄性SD大鼠60只，体质量380-400 g，购自河南省动物实验中心，动物许可证号：SCXK(豫)2017- 0001。所有动物实验均由河南大学第一附属医院伦理委员会批准。
1.3.2 主要试剂和仪器 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(11684817910)购自瑞士Roche公司；PI3K单克隆抗体(ab140307)、AKT多克隆抗体(ab18785)、磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-respon element binding protein，CREB)单克隆抗体(ab32515)、p-PI3K多克隆抗体(ab182651)、p-AKT多克隆抗体(ab81283)、p-CREB单克隆抗体(ab32096)、辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(ab6721，ab6728)均购自英国Abcam公司；PI3K抑制剂LY294002(HY-10108)购自美国MedChemExpress公司；RM2235型石蜡切片机购自德国Leica公司。
1.4 方法
1.4.1 动物分组及处理按照随机数字表法分为6组(n=10)：
①假手术组，只置入球囊而不阻断；②脊髓缺血再灌注组，从L3和L4间隙穿刺，髓鞘内注射20 μL生理盐水，置于麻醉室吸入空气氧气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型；
③七氟醚组，鞘内注射20 μL生理盐水，置于麻醉室吸入体积分数3.4%七氟醚、20%O2、5%CO2和61.6%的空气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型；④氙气组，鞘内注射 20 μL生理盐水，置于麻醉室吸入体积分数50%的氙气、25%的O2、5%CO2和20%的空气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型；⑤七氟醚联合氙气组，鞘内注射20 μL生理盐水，置于麻醉室吸入体积分数1.5%七氟醚、25%的氙气及20%O2、5%CO2及23.5%空气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型；⑥七氟醚联合氙气+PI3K抑制剂LY294002组，鞘内注射20 μL LY294002(10 μg/kg)，置于麻醉室吸入体积分数1.5%七氟醚、25%的氙气，20%O2、5% CO2及23.5%空气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型[11-15]。
1.4.2 脊髓缺血再灌注损伤模型制备所有大鼠采用4%水合氯醛0.1 mg/kg腹腔注射麻醉，采用恒温控制仪维持大鼠体温在36-37 ℃，经口气管插管，全程连接呼吸机(型号：ALC-V9，上海奥尔科特生物科技有限公司)按照容量控制模式行呼气末正压通气，吸入O2浓度33%，参照动脉血气情况以维持pH值7.35-7.45，二氧化碳分压 4.66-5.99 kPa，氧
Corresponding author: Song Junjie, Master, Attending physician, Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, Henan Province, China
Abstract
BACKGROUND: Spinal cord ischemia-reperfusion injury is a rious nerve tissue injury. Both voflurane and xenon have been reported to have a certain protective effect on ischemia-reperfusion injury of viscersl organs, but whether the combination of the two can alleviate spinal cord injury is still unclear. OBJECTIVE: To study the protective effect and mechanism of voflurane combined with xenon pretreatment in the rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, spinal cord ischemia-reperfusion group (IR), voflurane pretreated group (SI), xenon pretreated group (XI), voflurane and xenon pretreated group (SXI), PI3K inhibitor LY294002 group (SXI+LY), with 10 rats in each group. Sham group received sham operation, and the other groups received modeling operation for spinal cord ischemia-reperfusion injury. SI group, XI group, SXI group and
SXI+LY group were pretreated with 3.4% voflurane, 50% xenon, combination of voflurane and xenon, voflurane combined with xenon and LY294002 (the inhibitor of PI3K) respectively. The hind
limb motor function of rats was evaluated using Basso, Beattie and Bresnahan (BBB) scores. Normal neurons and apoptosis of anterior horn cells in the spinal cord were detected by Nissl staining and TUNEL staining. The expression and phosphorylation levels of PI3K, AKT and cAMP-respon element binding protein (CREB) in spinal cord tissue were detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The BBB scores for hindlimb motor function in the SI, XI and SXI groups were significantly higher than that in the IR group,
and that of SXI group was significantly higher than that of SI group and XI group, while the BBB score in the SXI+LY group was significantly lower than that
in the SXI group (all P < 0.001). Twenty-four hours after reperfusion, the apoptotic index of anterior horn cells in the SI group, XI group and SXI group was significantly lower than that in the IR group, that in the SXI group was significantly lower than that in the SI group and XI group, while that in the SXI+LY group was significantly higher than that in the SXI group (all P < 0.001). The expression of p-PI3K, p-AKT and p-CREB in spinal cord tissue was significantly incread
in the SI group, XI group and SXI group as compared with the IR group, with a highest expression level in the SXI group, and the expression in the SXI+LY group was significantly lower than that in th
e SXI group (all P < 0.001). Therefore, pretreatment using voflurane combined with xenon has a better protective effect against spinal cord ischemia-reperfusion injury than using single drug, and the mechanism may be related to the effect on PI3K/AKT/CREB signaling pathway. Key words: voflurane; xenon; spinal cord; ischemia-reperfusion injury; PI3K/AKT/CREB signaling pathway; pretreatment
Funding: the Scientific and Technological Rearch Program of Henan Provincial Education Department, No. 19A320021 (to SJJ)
How to cite this article: FAN JC, CHEN Y, SONG JJ. BSevoflurance combined with xenon pretreatment protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in a rat model. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2021;25(23):3660-3665.
Chine Journal of Tissue Engineering Rearch｜Vol 25｜No.23｜August 2021｜3661
分压11.97-19.95 kPa，调节呼吸频率为85-115次/min。右颈内动脉和尾动脉分别置入含有肝素生理盐水(1 U/mL)的导管并监测动脉血压。分离右股动脉，在距顶端1-3 cm处切开并置入可充气球囊的2F微球囊导管，逆行插入约10 cm，到达胸主动脉降部。2F微球囊导管用0.05 mL生理盐水膨胀阻塞动脉，开放右颈内动脉，将血液回流至肝素化柱内，维持动脉压约40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，而尾静
脉压急速下降至6.0-7.0 mmHg时，确认为动脉阻塞完全。维持缺血时间20 min，抽空球囊并将肝素化柱中的血液回输至大鼠体内。术后经尾动脉注射4 mg硫酸鱼精蛋白，拔出2F微球囊导管，外科缝合伤口。待大鼠恢复自主呼吸，拔出气管导管，回笼。造模后6 h采用Tarlov评分标准评估大鼠后肢神经行为学，≤3分时视为造模成功，造模成功率为100%。再灌注6，12，24 h后评估大鼠后肢运动功能；再灌注24 h后，采用10%的水合氯醛3 mg/kg深度麻醉处死大鼠，迅速取出损伤段(腰椎L2-L5)脊髓组织，将L3-L4节脊髓置于40 g/L的多聚甲醛中固定，经石蜡包埋后切片，用于尼氏染色及TUNEL染色。脊髓L4-L5放置于-80 ℃液氮中冻存备用。
1.4.3 后肢运动功能评分分别于再灌注6，12，24 h后采用BBB(Basso，Beattie and Bresnahan)后肢运动功能评分分别从后肢关节活性的数目和范围、步态及前后肢协调功能、爪的精细活动3个部分对各组大鼠后肢运动功能进行评分，总分值共21分[16]，分值越高，神经运动功能越好。由2名评估人员单独进行评分，且不对其公布大鼠分组情况。
1.4.4 尼氏染色将石蜡切片进行常规脱蜡处理，蒸馏水漂洗后置于1%甲苯胺蓝中40 min，蒸馏水冲洗，乙醇梯度进行脱水处理，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜下观察脊髓组织中尼氏染色阳性神经元(正常神经元)。随机选取5个视野观察，每组选取6张切片，分别计数每张片子中正常神经元的数目。
1.4.5 TUNEL染色检测脊髓前角细胞的凋亡石蜡切片进行常规脱蜡处理，PBS漂洗，蛋白酶K室温处理15 min，蒸馏水清洗后，滴加体积分数3% H2O2封闭10 min，PBS清洗后，滴加TUNEL反应混合液，37 ℃避光孵育60 min，再滴加DAPI染色液室温孵育5 min，PBS洗涤后，用抗荧光猝灭剂封固。荧光显微镜下观察脊髓前角细胞的凋亡情况。随机选取5个高倍视野，每组选取6张切片，计算脊髓前角细胞的凋亡指数，脊髓前角细胞的凋亡指数(%)=(凋亡细胞数目/总细胞数目)×100%。
1.4.6 Western Blot检测PI3K、AKT和CREB蛋白表达情况及其磷酸化水平 取冻存的全部脊髓组织(每组10只，共60只)进行匀浆，加入RIPA蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制剂)充分裂解，4 ℃下12 000 r/min离心10 min取上清。BCA法测定蛋白质浓度。各组取40 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后，用含有5%脱脂奶粉、0.05%吐温-20的PBS 室温封闭1 h。加入一抗：PI3K抗体(1∶1 000)、AKT抗体(1∶ 2 000)、CREB抗体(1∶500)、p-PI3K抗体(1∶1 000)、p-AKT 抗体(1∶500)、p-CREB抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶ 5 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或羊抗兔的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，洗膜。滴加电化学发光显色液，曝光显影。用Image J软件对目的条带进行分析，计算条带灰度值，以β-actin为内参标准化后，比较各组磷酸化水平/总蛋白的变化。
1.5 主要观察指标再灌注6，12，24 h后采用BBB后肢运动功能评分评估大鼠后肢运动功能；评分完成后尼氏染色检测脊髓组织中正常神经元数目，TUNEL染色检测前角细胞凋亡率，Western Blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的实验数据用x
-±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析纳入SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 BBB后肢运动功能评分各组大鼠再灌注6，12，24 h后，BBB后肢运动功评分结果见表1。与假手术组相比，脊髓缺血再灌注组大鼠的BBB后肢运动功能评分均降低，但随着再灌注时间的增加，BBB后肢运动功能评分也升高，差异有显著性意义(P均< 0.001)。在脊髓缺血再灌注大鼠模型中，再灌注6，12，24 h后，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组大鼠的BBB后肢运动功能评分高于脊髓缺血再灌注组，差异均有显著性意义(P均< 0.001)；其中七氟醚联合氙气组大鼠的BBB后肢运动功能评分最高，高于SXI+LY组，差异均有显著性意义(P均< 0.001)。
组织工程实验动物造模过程的相关问题
造模目的建立急性脊髓缺血再灌注损伤模型选择动物的条件SD成年大鼠，体质量400 g左右
模型与所研究疾病的关系通过阻断脊髓供血动脉血流一段时间并再次恢复血流，以模拟临床上脊髓缺血再灌注损伤的发生过程
动物来源及品系河南省实验动物中心，SD大鼠
造模技术描述分离右股动脉，切开并置入可充气2F微球囊导管，逆行
插入胸主动脉。通过膨胀微球囊导管膨胀阻塞动脉血流，
维持缺血时间20 min，而后抽空球囊恢复血流并将原血液儿童大便出血
回输至体内。造模过程监测动物生理指标
动物数量及分组方法共60只大鼠，分为6组，每组10只
造模成功评价指标造模后6 h采用Tarlov评分评估大鼠后肢神经行为学表
现，≤3分时为造模成功
造模后观察指标BBB后肢运动功能，脊髓组织中正常神经元的数目，前角
细胞凋亡率；PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达
造模后动物处理10%的水合氯醛3 mg/kg深度麻醉处死，取出腰椎L2-L5脊
髓组织在40 g/L的多聚甲醛中固定制成石蜡切片。其余材
料实验结束后统一焚烧
伦理委员会批准河南大学第一附属医院(科研-20191102) Rearch Article
3662｜中国组织工程研究｜第25卷｜第23期｜2021年8月
2.3 脊髓组织学观察及正常神经元计数对脊髓组织进行尼氏染色并统计正常神经元数目，结果分别见图1及表2。再灌注24 h后，假手术组脊髓组织中有大量正常神经元，其余各组脊髓组织中正常神经元数量明显减少，差异有显著性意义(P均< 0.001)。与脊髓缺血再灌注组相比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组中正常神经元的数量均增加(P 均< 0.001)，且七氟醚联合氙气组明显高于七氟醚组和氙气组(P均< 0.001)。而SXI+LY组中正常神经元的数量低于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P < 0.001)。
2.4 脊髓前角细胞凋亡情况 TUNEL染色检测脊髓前角细胞凋亡情况并计算细胞凋亡指数，结果见图2及表2。与假手术组比，其余各组脊髓前角细胞的凋亡率增多，差异有显著性意义(P均< 0.001)。与脊髓缺血再灌注组比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组的细胞凋亡指数降低(P=0.001，P < 0.001，
P < 0.001)，其中七氟醚联合氙气组低于七氟醚组和氙气组，差异有显著性意义(P均<0.001)；而SXI+LY组细胞凋亡指数高于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P < 0.001)。
2.5 脊髓组织PI3K/AKT/ CREB通路蛋白表达情况 Western Blot检测PI3K/AKT/CREB通路相关蛋白的表达，结果见图3。各组间PI3K/AKT/CREB蛋白的相对表达水平相比差异无显著性意义。与假手术组相比，脊髓缺血再灌注组脊髓组织中p-PI3K、p-AKT和p-CREB的表达水平升高，差异有显著性意义(P=0.006，P=0.003，P=0.038)。与脊髓缺血再灌注组相比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组中p-PI3K、p-AKT和p-CREB表达水平均升高，其中七氟醚联合氙气组各蛋白的表达水平高于七氟醚组和氙气组，差异均有显著性意义(P均< 0.001)。而SXI+LY组中p-PI3K、p-AKT和p-CREB的表达水平均低于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P均< 0.001)。
3 讨论 Discussion
脊髓是大脑和躯体之间传递运动和感觉信息的主要通路。脊髓缺血再灌注损伤作为原发性脊髓损伤的继发性伤害能够引起脊髓内神经元损伤甚至凋亡，造成脊髓功能障碍或丧失[17]。迄今尚未有方法能够有效治疗神经组织缺血再灌注损伤。此次研究参照文献，采用经胸主动脉球囊阻断+体循环低压的方法制备脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型[18]，结果表明，与假手术组相比，脊髓缺血再灌注组再灌注6，12，24 h后，后肢运动功能评分降低，提示模型制备成功。
长腿美女壁纸
现有研究表明，七氟醚预处理或氙气延迟后处理对脊髓缺血再灌注损伤具有明确的保护作用，但保护机制尚不明确。如曹宁等[11]研究发现体积分数3.4%七氟醚预处理能够抑制自噬/溶酶体途径，有效改善大鼠的运动神经功能，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。田蕾等[12]研究也表明体积分数50%氙气延迟后处理对兔脊髓缺血再灌注损伤引起的运动功能障碍有显著的保护作用。同时预实验中采用不同浓度梯度的七氟醚(0%-4%)和氙气(0-75%)分别预处理脊髓缺血再灌注损伤，通过评估脊髓缺血再灌注损伤大鼠的后置运动功能等，结合上述文献报道，选择体积分数3.4%的七氟醚和50%的氙气预处理脊髓缺血再灌注损伤大鼠。此次研究中分别采用体积分数3.4%的七氟醚和50%的氙气预处理脊髓缺血再灌注损伤大鼠，结果发现再灌注6，12，24 h后，七氟醚、氙气单独预处理均能够改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的后肢运动功能，保护正常神经元，抑制脊髓细胞的凋亡，提示七氟醚和氙气预处理均能够减轻大鼠的脊髓缺血再灌注损伤，与上述研究结果一致。同时LUO等[13]在体外实验中发现，氙气联合七氟醚预处理能够更为显著地减少氧糖剥夺引起的神经元细胞的损伤及凋亡，体内研究发现七氟醚联合氙气预处理能够发挥持久的神经保护作用，有效预防围产期新生儿窒息造成的神经损伤。研究还发现体积分数1.5%的七氟醚和25%的氙气均能够缩小缺血再灌注损伤的梗死面积，但未发现其保护作用。而此次研究根据现有研究结果及进行的预实验结果，采用体积分数1.5%的七氟醚联合25%的氙气预处理脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型，发现七氟醚联合氙气预处理能够进一步改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的后肢运动功能，减少脊髓前角细胞的凋亡，减轻脊髓缺血再灌注损伤；与七氟醚和氙气单独预处理相比，差异有显著性意义。同时此次研究结果发现，七氟醚及氙气预处理能够有效激活PI3
K/AKT/CREB信号通路，因此推测七氟醚和氙气对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用可能与PI3K/AKT/CREB信号通路的激活有关。
PI3K/AKT信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，参与调控多种影响细胞生存的转录因子，如CREB和核
表1 ｜各组大鼠BBB后肢运动评分的比较 (x
-±s，n=10，分)
Table 1 ｜Basso, Beattie and Bresnahan scoring for asssment of rat
hindlimb motor function
组别再灌注后时间
6 h12 h24 h
假手术组21.0±0.021.0±0.021.0±0.0
脊髓缺血再灌注组 3.3±0.7a 6.6±0.8a9.3±0.5a
七氟醚组 6.2±0.8abc9.0±0.7abc12.6±0.8abc
氙气组 6.1±0.6abc8.8±0.6abc12.2±0.8abc
七氟醚联合氙气组7.8±0.8ab10.9±0.9ab16.5±0.9ab
SXI+LY组 4.0±0.5ac7.1±0.7ac9.5±0.7ac
表注：SXI+LY组为七氟醚联合氙气+PI3K抑制剂LY294002组。与假手术组相比，
a P < 0.05；与脊髓缺血再灌注组相比，
b P < 0.05；与七氟醚联合氙气组相比，
c P < 0.05
表2 ｜各组大鼠再灌注24 h后脊髓组织运动神经元及前角细胞凋亡指
数的比较 (x
-±s，n=10)
Table 2 ｜Comparison of apoptotic index of motor neurons and anterior
horn cells in the rat spinal cord at 24 hours after reperfusion
组别正常神经元数量前角细胞凋亡指数(%)
假手术组38.9±1.710.2±2.5
脊髓缺血再灌注组10.5±1.4a36.4±7.3a
七氟醚组18.6±2.2abc25.2±4.2abc
氙气组17.8±1.8abc23.6±4.6abc
七氟醚联合氙气组26.4±2.0ab15.8±3.1ab
SXI+LY组12.2±1.9ac31.8±6.7ac
表注：SXI+LY组为七氟醚联合氙气+PI3K抑制剂LY294002组。与假手术组相比，
海底捞可以自带酒水吗>先的反义词a P < 0.05；与脊髓缺血再灌注组相比，
b P < 0.05；与七氟醚联合氙气组相比，
c P < 0.05
Chine Journal of Tissue Engineering Rearch｜Vol 25｜No.23｜August 2021｜3663
3664 ｜中国组织工程研究｜第25卷｜第23期｜2021年8
月
假手术组 脊髓缺血再灌注组 七氟醚组
氙气组 七氟醚联合氙气组七氟醚联合氙气+PI3K 抑制剂LY294002组
图注：黑色箭头表示尼氏染色阳性的细胞(正常神经元)。再灌注24 h 后，假手术组脊髓组织中有大量正常神经元，其余各组脊髓组织中正常神经元数量明显减少图 1｜各组大鼠再灌注24 h 后脊髓组织尼氏染色情况(Bar = 25 μm)
Figure 1 ｜Nissl staining of rat spinal cord tissue at 24 hours after reperfusion (scale bar=25 μm)图注：与假手术组相比，a
P < 0.05；与脊髓缺血再灌注组相比，b
P < 0.05；
与七氟醚联合氙气组相比，c
P < 0.05
图 3｜Western blot 检测PI3K/AKT/CREB 通路蛋白及磷酸化水平
Figure 3 ｜Western blot detection of PI3K/AKT/CREB pathway proteins and their phosphorylated levels
DAPI TUNEL MERGE
假手术组
脊髓缺血再灌注组
七氟醚组
DAPI TUNEL MERGE
氙气组
七氟醚联
合氙气组七氟醚联合
氙气+PI3K 抑制剂LY294002组
图注：与假手术组比，其余各组脊髓前角细胞的凋亡率增多；与脊髓缺血再灌注组比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组的细胞凋亡指数降低；其中七氟醚联合氙气组低于七氟醚组和氙气组；而SXI+LY 组细胞凋亡指数高于七氟醚联合氙气组
图 2｜TUNEL 染色检测脊髓组织细胞凋亡情况(Bar = 25 μm)
Figure 2 ｜Apoptosis in anterior horn cells of the spinal cord by TUNEL staining (scale bar=25 μm)
PI3K p-PI3K AKT p-AKT CREB p-CREB β-acti n
文档图标
848456564040
43
假手术组 脊髓缺血再灌注组
七氟醚组
氙气组
七氟醚联合氙气组七氟醚联合氙气+PI3K 抑制剂
LY294002组
1.210.80.6
0.40.20
p -P I 3K /p -A K T /p -C R E B 相对表达
p-PI3K/PI3K
p-AKT/AKT p-CREB/CREB
金属活动顺序
abc abc
abc abc
abc abc
ab
ab
ab
ac
ac
ac
a
a
a 因子κB 等，进而调控凋亡效应因子的表达，在维持细胞生
存和抑制细胞凋亡中发挥关键作用
[19-21]
。有研究证实，在局
部脑缺血再灌注损伤模型缺血后处理可通过激活PI3K/AKT 信号通路产生长时程脑保护效应，表明PI3K/AKT 信号通路在神经细胞保护中起重要作用
[22]
。多项研究表明，七氟醚能够激
活PI3K/AKT 信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，从而发挥脑保护效应
[23-24]
。刘诗瑶等[25]
研究也发现，氙气延迟后处合适的英文
理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用是通过PI3K/AKT 通
路发生的。LUO 等[13]
发现氙气和七氟醚预处理对围产期缺
氧缺血性脑损伤的神经保护机制与PI3K/p-AKT/p-CREB 信号通路相关。此次研究进一步采用LY294002抑制PI3K 信号的激活，发现LY294002能够抑制PI3K/AKT/CREB 信号通路的激活，从而逆转七氟醚联合氙气对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。因此推测七氟醚联合氙气能够激活PI3K/AKT
信号通路，而活化的AKT 能够促进CREB 的磷酸化，抑制脊髓前角细胞的凋亡，从而发挥对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。值得
提出的是，此次研究中脊髓缺血再灌注组组p-AKT 高于假手术组，与部分研究一致
[26]
，但也有研究结果显示假手术组
AKT 的磷酸化水平高于其他实验组[27]，这可能是与再灌注损伤后的检测时间点差异有关
[28]
。
清炒豆芽的做法
综上所述，七氟醚和氙气能够减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤，两者联用能够进一步增加脊髓神经保护作用，其机制
kD
假手术组
脊髓缺血再灌注组氙气组
七氟醚联合氙气组
七氟醚组
七氟醚联合氙气+PI3K 抑制剂LY294002组
研究原著
