槲皮素与桑色素ESI-MS裂解行为的比较分析
尹智慧;孙长海;方洪壮
【摘 要】运用量子化学方法辅助解析并比较槲皮素与桑色素在电喷雾离子阱质谱(ESI-MS)负离子模式下的裂解行为.依据密度泛函理论(Density functional theory,DFT),在B3LYP/6-31G(d)水平,对槲皮素与桑色素的分子空间构型进行优化,确定稳定的几何构型与去质子化位点,在RB3LYP/6-31+ G(2d,2p)水平,计算相对碎裂电压下的二级质谱中碎片离子处于稳定状态时的能量,通过比较准分子离子稳定构型并结合基组重叠误差(Basis t superposition error,BSSE)校正后的键解离能(Bond dissociation energy,BDE),推导了质谱碎裂过程.结果显示:槲皮素的稳定构型为A,B,C环处于同一平面,桑色素上的2’-OH使得B环与AC环之间翻转一定角度,二面角D(1,2,1 ′,6 ′)为-134.662 4°.槲皮素与桑色素的质谱裂解过程主要通过C环跨环裂解产生,且具有多种开裂方式,开裂先后顺序为:1,2开裂、0,2开裂、1,3开裂、1,4开裂与0,4开裂,分别生成碎片离子1,2A-,0,2A-,1,3A-,1,4A-与0,4A-,并逐步进行后续裂解,而2’-OH的存在促进了桑色素的裂解.该研究为进一步揭示黄酮醇类化合物的质谱裂解规律提供了理论依据.%The fragmentation behaviors of quercetin and morin were analyzed and compared by t
he quantum chemistry method with electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) in negative ion mode.Bad on the density functional theory(DFT),at the level of B3LYP/6-31 G(d),quantum chemistry calculation was carried out to optimize the molecular spatial configurations of quercetin and morin,in order to confirm the stable geometric configurations and deprotonation locations of quasimolecular ions.The energy of fragment ions on the stable state under the relative framentation voltage in the cond order mass spectrometry,was calculated at the level of RB3LYP/6-31 + G(2d,2p).The fragmentation pathway was deduced by comparing the stable configurations of quasi-molecular ions and combined with basis t superposition error (BSSE)-corrected bond dissociation energy (BDE).The results indicated that the stable configuration of quercetin was that the A,B,C rings stayed in the same plane,but morin was not like this becau of the 2'-OH,and the dihedral angle between B ring and AC rings was-134.662 4°.The fragmentation process of quercetin and morin occurred mainly through the cross-ring cleavages of C ring with various of cleavage ways.The precedence order was:1,2 cleavage,0,2 cleavage,1,3 cleavage,1,4 cleavage and 0,4 cleavage,the fragment ions of
1,2A-,0,2A-,1,3A-,1,4A-and 0,4A-were generated,respectively.The difference between them was that the existence of 2'-OH on morin facilitated the cross-ring cleavages.Subquently,the rest of fragment ions were produced step by step.This study provided a theoretical basis for further revealing the fragmentation pathway of flavonol compounds.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2017(036)002
【总页数】广场舞经典歌曲7页(P205-211)
【关键词】黄酮醇;量子化学;电喷雾离子阱质谱;裂解行为
情人节诗词【作 者】尹智慧;孙长海;方洪壮
【作者单位】佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007
【正文语种】中 文
【中图分类】O657.63;TQ460.726
槲皮素与桑色素是植物界中广泛分布的以C6-C3-C6为基本碳架的黄酮醇类化合物，常以游离态或糖苷形式存在[1-2]。两者互为同分异构体，化学结构上的区别在于B环上的二羟基取代位置不同。在药理活性方面，槲皮素与桑色素均具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等作用，近几年被广泛用于药品与保健食品的研发[3-5]。电喷雾电离源(Electrospray ionization，ESI)质谱是质谱家族中的重要组成部分，虽然其在天然化合物的分析中已得到广泛的应用，但其质谱裂解机理与规律尚多有空白。质谱试验中，离子化过程非常短暂，难从实验上观察裂解过程，而将量子化学计算引入到质谱解析中，通过计算分子结构中的电荷密度、轨道、能级等各项参数，确定分子最稳定的电子态构型[6-8]，模拟整个化合物的具体裂解过程[9]，得到有机化合物的质谱形成机制等信息，可为谱学试验结果的解析提供理论依据。本研究从分子水平角度上出发，运用量子化学的计算方法，比较分析了槲皮素与桑色素化合物负离子模式下的电喷雾离子阱质谱裂解行为，尝试揭示槲皮素与桑色素两黄酮醇类化合物的质谱裂解机理。
1.1 仪器与试剂
Agilent G6310质谱仪：美国安捷伦公司产品，配ESI源，离子阱质量分析器和Data Analysis数据处理软件等。槲皮素对照品(纯度>98%,天津一方科技有限公司)；桑色素对照品(纯度>98%,大连美仑生物技术有限公司)；甲醇(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司)。
1.2 质谱条件
采用ESI负离子模式检测，喷雾电压为3.5 kV，毛细管电压为13 V，毛细管温度325 ℃，鞘气和辅助气为氮气，鞘气流速10 L·min-1，辅助气流速0.15 L·min-1，氦气为碰撞气进行碰撞诱导解离分析，碎裂电压：自动1.00 V，手动0.80 V，扫描范围：m/z 50～330。流动注射泵直接进样，流速0.5 mL·h-1。
1.3 量子化学计算方法
量子化学计算采用Gaussian 03程序完成。在B3LYP/6-31G(d)水平分别进行几何结构优化及频率计算，确定优势构象与去质子化位点，且在此基础上，以同水平计算质谱碎片离子
稳定构型，并在RB3LYP/6-31+G(2d,2p)水平计算碎片离子处于稳定状态时的能量，同时运用Counterpoi Corrrection方法进行基组重叠误差(Basis t superposition error，BSSE)计算。经BSSE校正的键解离能(Bond dissociation energy，BDE)根据公式进行计算：BDE=E(A)+E(B)-E(AB)+E(BSSE)，式中E(AB)为母离子总能量，E(A)为产物碎片离子的能量，E(B)为中性碎片的能量，E(BSSE)为基组重叠误差值[10-12]。
2.1 分子稳定结构
质谱真空条件下，分子主要以能量最低的形式存在，因此本研究以分子稳定的空间构型优化为前提，以保证其后的研究。槲皮素与桑色素的分子结构与原子编号及C环开裂位置编号如图1所示，其中，槲皮素：R1=H，R2=OH；桑色素：R1=OH，R2=H。图1中0，1，2，3，4 为C环开裂位置的编号，分别对应化学键C9—O1，O1—C2，C2—C3，C3—C4，C4—C10。
2.1.1 能量分析 对槲皮素与桑色素可能的初始构型分别进行结构优化、频率计算与能量计算，确定了各自分子稳定构型，如图2所示。两者经过分子结构优化及振动分析后的最终结果均符合收敛标准(Maximum Force 0.000 450；RMS Force 0.000 300；Maximum Displa
cement 0.001 800；RMS Displacement 0.001 200)，频率计算均未出现虚频，说明计算得到的初始构型稳定，从相应的最终优化结构中得到的分子构象、能量、二面角、偶极矩等参数有效可靠，从理论上可作为两种化合物的分析比较。
早餐饼的做法2.1.2 构型分析 由表1中的数据及图2可以看出，槲皮素分子优势构象为A,C,B三环处于同一平面时的共轭结构，与文献报道一致[13-14]，此时分子体系的总能量最低，结构最为稳定，分子中的原子和化学键呈自由伸展的状态。桑色素分子A环与C环仍处于同一平面，但由于B环2′-位存在羟基，使B环与C环之间存在空间位阻，由此使得桑色素的分子优势构象为非平面，其B环与AC环之间二面角D(1,2,1′,6′)为-134.662 4°。
2.2 去质子化位点
谏逐客书翻译由于选择的是电喷雾电离源负离子模式，羟基相较于苯环更易丢失质子氢而发生去质子化。槲皮素与桑色素均有5个羟基，分别位于3-，5-，7-，4′-，3′-或2′-，因此对几种可能的[M-H]-构型进行能量计算，对表2中数据结果作分析比较可得到，槲皮素与桑色素在丢失B环上4′-H的情况下，体系能量达到最低，是[M-H]-最稳定的构型。两化合物间比较，4′-H丢失时的能量相差49.787 3 kJ·mol-1，槲皮素相对更为稳定。结合“2.1”研究结果可知，槲皮
汽车修理学习素为一平面结构，失去4′-H后，产生共振结构，相应的位置均形成双键，使原共轭系统的共轭增长，共轭效应加大，整体结构更为稳定。槲皮素[M-H]-稳定构型的偶极矩为10.058 1 D，桑色素[M-H]-为31.747 2 D，通过比较两者的偶极矩大小得知，槲皮素准分子离子的极性比桑色素小得多，说明其[M-H]-构型更为稳定。
2.3 质谱结果
在质谱试验过程中，槲皮素与桑色素均出现m/z 301.0的准分子离子峰，分别将其作为母离子手动提取二级质谱图，得到ESI-MS2质谱图(如图3所示)。两种物质的分子在电喷雾离子阱质谱中的碎片离子基本相同，说明可能具有相同的裂解方式。分析图3发现，槲皮素的二级质谱图产生的碎片中，碎片离子m/z 150.9，178.8的丰度最为明显，而桑色素则为m/z 124.9，150.9最明显，两者中等质量数的碎片离子峰居多，且相对峰强度较大，推测两种黄酮醇在质谱碎裂过程中主要发生了环开裂现象，此外还经历了丢失中性H2O，CO和CO2等过程。
2.4 量化计算
黄酮醇类化合物在质谱裂解过程中由于苯环具有较大稳定性不易开裂，因此主要发生C环的retro-Diels-Alder(RDA)裂解[15-18]，裂解产物为A、B环各自带有C环的一部分。几种裂解方式如图4所示，相应产物分别用A与B部分表示。经分析发现在同一裂解方式下槲皮素、桑色素跨环开裂得到的A部分碎片离子均为同一结构。
为深入探究C环裂解过程，对几种跨环裂解方式进行全面的BDE计算分析。考虑到E([M-H]-)相较于E(A-)+E(B)的降低除了来自真实的A-与B的相互作用能外，还有一部分是由于两者的基函数在[M-H]-体系中的重叠，因此加入基组重叠误差(BSSE)对BDE结果进行校正[19]。计算涉及的碎片离子均为能量达到最低时的构型。槲皮素与桑色素各跨环裂解方式下的产物示意图如图5所示，由“2.2”研究得两者的[M-H]-能量分别为-1 103.785 8 a.u.与-1 103.766 9 a.u.，相应的BDE值见表3。
槲皮素与桑色素计算所得的BDE能量整体上趋势相同，按能量大小由低到高依次为BDE1,2<BDE0,2<BDE1,3<BDE1,4<BDE0,4，通过比较单个C环跨环裂解的能量发现，桑色素所需能量均小于槲皮素，验证了如上所述槲皮素分子构型比桑色素稳定的结论。如此能量高低的不同在质谱中表现为：首先发生1,2开裂，生成1,2A-碎片离子m/z 179；其次，
发生0,2开裂，生成0,2A-碎片离子m/z 163；然后，发生1,3开裂，生成1,3A-碎片离子m/z 151；再次，发生1,4开裂，生成1,4A-碎片离子m/z 125；最后，发生0,4开裂，生成0,4A-碎片离子m/z 107。以上碎片离子均在质谱结果上得以体现。蝎子的养殖技术及市场前景
反常的是，图3中桑色素的碎片离子1,2A-丰度较低，但其理应优先开裂且丰度最大，因此对其碎片离子结构做进一步量子化学计算。1,2A-稳定构型有两个相邻的羰基取代基，由于羰基具有较强电负性，在质谱试验中易脱去，猜测可能在碰撞过程中失去了中性CO而裂解。图6A为碎片离子1,2A-的静电势(Electrostatic potential，ESP)图，ESP图显示了碎片离子的静电势分布、形状、偶极矩等相关信息，能够直观地了解相对极性，可用于观测正负电荷的分布情况和预测反应活性位点。红色部分为负电荷分布区，蓝色部分为正电荷分布区。通过比较图6中相邻取代的两个羰基上所覆盖的颜色发现，4-位羰基周围的负电荷分布比3-位羰基更多，可以初步推断4-位羰基的电负性更强。图6B为碎片离子1,2A-的电荷分布情况，可以看到所带负电荷最多的部位在4-位羰基的氧原子上，进一步可以确证，4-位羰基的电负性更强，因此碎裂电压的驱动力使其更易脱去进行下一步裂解，生成1,3A-碎片离子。这解释了在碎裂过程中，虽然1,2A-所需BDE能量更低，但1,3A-碎片离子的相对丰度强于1,2A-的原因。另外，相对碎裂电压条件下，相较于槲皮素而言，桑色素[M-H]-生成
1,2A-所需的BDE能量更低，能够更早地脱去4-位羰基进行后续裂解，表现为桑色素1,2A-碎片的离子丰度明显低于槲皮素的1,2A-。碎片离子1,3A-稳定构型上还带有1个羰基与1个氧原子，在一定程度上还可继续脱去形成0,4A-碎片离子。
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