•论著•
泛酸激酶相关神经变性病新变异致病性
鉴定及表型-基因型相关性研究
杜鹏"2李宁2蒋玮莹I
」中山大学中山医学院遗传学教研室，广州510080；$广州市妇女儿童医疗中心
临床基因检测诊断中心510623
通信作者：蒋玮莹，Email:jiangwy@mail.
新郑黄帝故里【摘要】目的对1个泛酸激酶相关神经变性病(pantothenate kina-associated neurode
generation,PKAN)家系进行致病性变异鉴定并对已发表的文献进行综述，为以后临床诊断、产
前诊断和遗传咨询提供理论依据。方法抽取家系成员的外周血提取基因组DNA，用PCR
扩增P4NK2基因并进行Sanger测序。根据ACMG/AMP指南对新变异进行致病性分析。同时
通过数据库查询已发表的病例并对其进行综述。结果在先证者中发现2个可能的变异，其
中c.1355A>G(p.D452G)来自先证者的母亲，为已知的致病性的变异,c.833G>A
(p.R278H)来自先证者的父亲，为新变异，根据ACMG/AMP国际遗传变异分类标准与指南将
其定义为可能致病性的变异。通过査询数据库回顾了80篇文献中的263个患者，详细总结
了临床表型和变异位点，对基因型和表型的相关性进行分析，发现肌张力障碍是PKAN最常
见的表型，142个致病性的变异位点中最常见的变异为c.1583C>T(p.T528M)(43/526)o
值得注意的是目前报道的变异位点随机分布在PANK2基因的c.390C之后，但在c.390C之
前未报道任何致病性的变异。结论c.833G>A(p.R278H)是引发PKAN的新的可能致病
性变异。已发表病例的总结能够为今后相关患者的临床诊断、遗传学诊断及生育指导提供重
要依据。
【关键词】泛酸激酶相关性神经变性病;PANK2；新变异；致病性鉴定
新农村建设规划基金项目：广州科技计划项目(201604020020)
D0I：10.3760/231536-20200607-00043
Pathogenicity identification and genotype-phenotype correlation of a new variant of pantothenate
kina-associated neurodegenerative dias
Du Peng"'2,Li Ning2,Jiang Weiying1
1Department of Medical Genetics,ZhongShan School of Medicine,Sun Yat-n University,Guangzhou
510080,China；2Department of Clinical Genetic Testing and Diagnosis Center,Guangzhou Women and
Childrens Medical Center,Guangzhou510623,China
Corresponding author:Jiang Weiying,Email:jiangwy@mail.
[Abstract]Objective To identify PANK variants of a family with pantothenate kina・associated
neurodegeneration(PKAN)and review the published literatures to provide theoretical basis for future clini
cal diagnosis,prenatal diagnosis and genetic counling.Methods Genomic DNA was extracted from the
peripheral blood of family members.PCR was generated to amplify the PANK2gene and Sanger quencing
was performed.Pathogenicity analysis of new variant was obtained according to ACMG/AMP guidelines.
We also reviewed the published cas through the databa.Results Two variants of PANK2were found
in the proband.One was a maternal variant c.1355A>G(p.D452G),which was known as pathogen
ic.The other was a paternal variant c.833G>A(p.R278H),and we defined it as potentially pathogenic according to the criteria and guidelines of ACMG/AMP genetic variation classification.We reviewed 263patients in80articles and summarized the clinical phenotype and variant sites in detail.Dystonia is
the most common phenotype of PKAN and the most com m on variant is c.1583C>T(p.T528M) (43/526)in142variants.It is intriguing that the variants reported currently are distributed after c.390 C of PANK2gene.Conclusion c.833G>A(p.R278H)is a novel variant likely causing PKAN. Our summary of published cas can provide important basis for PKAN patients in clinical diagnosis,prenatal diagnosis and fertility guidanee in future.
[Key words]Pantothenate kina-associated neurodegenerative dia；PANK2；Novel variant；Pathogenicity identification
Fund program:Science and Technology Program Project of Guangzhou(201604020020)
DOI：10.3760/231536-20200607-00043
泛酸激酶相关神经变性病(PKAN,OMIM# 234200)是一种由PANK2基因变异引起的常染色体隐性遗传病，其特征是铁沉积过多，由Hallervorden和Spatz于1922年首次报道，因此又叫Hallervorden-Spatz综合征(Hallervorden-Spatz syndrome,HSS)11o该病的患病率极低，约为1/1000000~3/1000000⑵。PANK2是PKAN的唯一致病基因，由Zhou等⑶于2001年首次发现，定位于20P12.3-P13，编码泛酸激酶，基因全长38120bp，包括7个外显子和6个内含子，mRNA全长2280bp，编码570个氨基酸。
泛酸激酶在辅酶A的合成中起重要调节作用。在泛酸激酶和半胱氨酸合成酶的作用下，泛酸(维生素B5)和半胱氨酸经过两步反应生成4—磷酸泛酰半胱氨酸，随后经过脱竣、结合腺昔基和磷酸化后生成辅酶A。辅酶A在细胞内的多种代谢途径中起重要作用，目前认为辅酶A缺乏导致的线粒体功能障碍和脂质代谢异常是导致PKAN发作的主要原因⑷。PANK2基因变异导致的泛酸激酶活性降低或合成不足会引发细胞膜脂质合成障碍和脂肪P氧化异常，这一现象在高耗能细胞(神经细胞、视网膜感光细胞等)中变化更加明显⑸。另外辅酶A 合成障碍时会导致其合成原料半胱氨酸堆积，半胱氨酸能够与铁离子发生螯合反应，导致铁在相关部位大量蓄积。在铁存在的条件下，半胱氨酸能够迅速发生自身氧化，进而产生大量自由基，过量的自由基导致细胞脂质过氧化，引起氧化损伤，致使细胞变性坏死⑷。铁在苍白球和黑质中大量存在，同时该区域有丰富的泛酸激酶受体，这可能是PANK2缺乏后主要影响上述部位的原因E。
PKAN不同患者的临床表型具有很大差异性，肌张力障碍和头颅核磁共振显示的苍白球两侧对称低信号强度、中央高信号强度的虎眼征是其最典型的特征，另外患者还常常出现构音困难、帕金森、发育落后或倒退、视力下降、手足徐动、吞咽困难、视网膜色素变性、抑郁、强迫症、暴力倾向和小脑萎缩等多种表现⑷。根据发病年龄和发病后病情进展将PKAN划分为典型和非典型两种，典型患者发病年龄一般＜10岁，病情进展快速，非典型患者发病年龄一般M10岁，病情进展较慢9回。本文对1例PKAN患者的新变异进行了致病性鉴定，并回顾了已发表的资料，为临床诊断、遗传学诊断，尤其是生育指导提供了一定的参考。
1材料与方法
1.1研究对象
先证者，男，9岁，汉族，广东籍，因进行性写字障碍一年就诊。父母体检结果显示未见明显异常，无家族史，非近亲结婚。先证者有一表型正常的叔叔同时纳入研究。本研究均在其本人或监护人处获得知情同意并于广州市妇女儿童医疗中心医学伦理委员会处获得批准(201606160)o
1.2神经影像学检查
由放射科医生对先证者进行头部MRI检查。
1.3PANK2基因检测
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抽取家系成员的外周血提取基因组DNA，使用Primer 5.0软件设计引物(见表1)对PANK2基因进行PCR扩增(扩增范围包括所有外显子区、内含子-外显子连接区及5,、3'端非翻译区)，并对扩增产物进行Sanger测序。测序结果与参考序列NM_153638.2(GRCh37 (hgl9))进行比较，找出所有变异。
1.4新变异致病性鉴定
由于PKAN表型的异质性，不能只通过临床表现进行确诊，必须找到PANK2的双致病变异才能确诊。通过对先证者及其家系的Sanger 测序发现先证者存在c.833G>A(p.R278H)和c.1355A>G(p.D452G)复合杂合变异。c. 1355A>G(p.D452G)为已报道的致病性变异⑴］,c.833G>A(p.R278H)在千人基因组数据库(1000Genomes Project)、人类基因突变数据库(HGMD)、NCBI单核昔酸多态性数据库(NCBI dbSNP)和gnon.AD数据库(Genome Aggregation Databa)中进行检索，均未报道，对于
表1用于Sanger测序的PANK2基因引物Table1PANK2gene primers ud for Sanger quencing
引物序列长度（bp）El-F5Z-GTCGCCCC A GGAGAGTTC-3'
643
El-R5z-TGTAAGAGCCCAGTCGATCC-3'
E1-2F5'-GAGGAGGCGAGA A GGAATC-3'
500
E1-2R5z-GTACCGCTTTCGGAGCAC-3'
E2-F5^CCTAGCGTTTGAAATA A GTTGCT-3'
597
E2-R5-GGCCA A CTCCTATCACTAGC-3'
E3-F5'-GGGATGCCTTATTGAATGGA-3'
430
E3-R5Z-TTCACCTAACAGGTTCTTGAAGG-3'
E4-F5z-TTGCATGATTGGGTTGGATA-3'
392
E4-R5'-ACCTCATGATCTGCCCATCT-3'
E5-F5'-TTGAACAGATGCTCCATTGC-3'
386
E5-R5Z-CCCACCCCAAATGACTACAT-3'
E6-F5'-CCCTGGACCAACTGGACTAA-3'
376
E6-R5A A GAAAC A CTGCAGCCCATT-3'
E7-F5'-GGAAATGGGTATGCTGTG-3'
三年级数学题874
E7-R5'-TAGTCCTCCAGATTGTGC-3'新发变异只有进行可靠地致病性鉴定，才能准确的诊断致病原因，并对下一步治疗和生育提供指导。
1.4.1物种保守性分析随机选择10个以上的不同物种使用Clustal Omega对变异位点进行氨基酸保守性分析，通过变异位点保守强度来判断致病性强弱。
1.4.2利用PolyPhen-2、PROVEAN和SIFT预测新变异致病性使用PolyPhen-2( genetics,bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml)、PROVEAN(/index.php)和SIFT(/)对PANK2基因c.833G>A(p.R278H)进行预测，为致病性强弱提供依据。
1.4.3蛋白质三级结构预测与分析利用在线工具SWISS-MODEL(pasy. org/)对变异前后蛋白质三维结构进行预测，并通过Pymol软件对预测结果进行分析，通过比较变异前后结构的改变来预测突变对蛋白功能的影响。
1.5文献综述
通过中国知网、万方数据库、Web of Science、PubMed和Google Scholar对已发表的文献进行检索，并对所有病例的临床表现和遗传信息进行统计分析。
2结果
2.1神经影像学检查结果
头部MRI影像显示头颅轴位TI、T2W1，失状T2W1扫描，各层面显示清晰。双侧苍白球T2信号稍高，形态对称(虎眼征)；其余双侧大脑半脑、脑干、小脑形态、结构未见异常，脑灰、白质分界清楚，其内未见异常信号，脑室系统无扩大、变形，中线结构居中。
2.2PANK2基因检测结果
对测序结果进行分析发现，在先证者PANK2基因中发现c.833G>A(p.R278H)和c.1355A>G(P.D452G)
的复合杂合变异(见图1)。其中c.833G>A(p.R278H)来自先证者的父亲，纳入检测的先证者的叔叔是该突变的携带者；c.1355A>G(p.D452G)来自先证者的母亲。
ZWU/KA aa /u A
G T G G & C£CAAAGG
GTGG 入 C2.C 入 入 入 G G
图1 PANK2测序结果Fig. 1 PANK2 quencing results
注：A.无关正常对照；B.先证者,c.833G>A(p. R278H) ；C.先证者父亲，c. 833G > A(p. R278H)；D.先证者母浙江分数线
亲，正常;E.先证者叔叔,c. 833G > A(p. R278H) ；F.无关正常对照；G.先证者，c. 1355A > G(p. D452G) ；H.先证者
父亲，正常；I •先证者母亲,c. 1355A >G(p. D452G) :J.先证者叔叔，正常如鼓琴瑟
Note ： A. Irrelevant normal control ； B. Proband , c. 833G > A ( p. R278H ) ； C. Proband * s father , c. 833G > A
(p. R278H ) ; D. Proband * s mother, nonnal ； E. Proband * s uncle,c. 833G > A ( p. R278H ) ； F. Irrelevant normal control ；
G. Proband,c. 1355A >G(p. D452G) ； H. Proband * s father ,normal ； 1. Pn )band's mother,c. 1355A > G( p. IM52G)；
J. Proband * s uncle , normal
2.3 新变异致病性鉴定结果2.
3. 1物种保守性分析结果11个不同物种 的保守性分析结果（见图2）表明PANK2蛋白 第278位氨基酸均为R （用红色表示），说明第
278位的精氨酸对于PANK2蛋白维持其功能
具有重要作用，当其发生改变后可能会影响 PANK2蛋白的结构导致其失去原有的生物学
功能。
SPIQ9BZ23IPANK2_HUMAN
P.278R
LTLCGfikGNLHFIRFPTHDMPAFIQMGRDKNFSSLHTVFCATG
TR |A0A1L1RSZ2|AOA1L1RSZ2_CHICK LTLCG R K.GNLHFIRFPTHDMPAFIQMGSEKHFSSLHTTICATG
TR |K7DB52|K7DB52_PANTR TRIQ7M753|Q7M753_MOUSE
LTLCGFKGNLHFIRFPTHDMPAFIQMGRDKNFSSLHTVFCATG LTLCG r |k gnlhfirfpthdmpafiqmgrdknfsslhtvfcatg
TR|A0A287B3C3|A0A287B3C3_PIG
LTLCC F KGNLHFIRFPTHDMPAFIQMGRDKNFSSLHTVFCATG
TR|A0A0D9RKF8|AOAOD5RKF8_CHLSB LTLCGRKGNLHFIRFPTHDMPAFIQMGRDKNFSSLHTVFCATG
TR|W5NRI3|W5NRI3_SHEEP
LTLCG RlKGNLHFIRFPTHDMPAFIQMGRDKNFSSLHTVFCATG
TR|A0A2J8RZV1|A0A2J8RZV1_PONAB LTLCGRkGNLHFIRFPTHDMPAFIQMGRDKNFSSLHTVFCATG
TR|F1PZF2|F1PZF2_CANLF LTLCGPKGNLHFIRFPTHDMPAFIQMGRDKNFSSLHTVFCATG
TR | A0A096NVC6 | AOAO 5 6JiVC 6_PAPAN TR|H2R312|H2R312_PANTR
■gr K gnlhfirfpthdmpafiqmgrdknfsslhtvfcatg
LTLC (yK.GNIiHFIRFPTHDMPAFIQMGRDKNFSSLHTVFCATG
LTLCi 图2物种保守性分析结果
未来的车
Fig. 2 Result of species conrvation
analysis
国际遗传学杂志 2020 年 10 月 15 日第 43 卷 第 5 期 Int J Genet Oct. 15 ,2020, Vol. 43 ,N 。. 5• 275 •
2.3.2 PolyPhen -2、PROVEAN 和 SIFT 预测结果 对于 PANK2 基因中 c. 833G > A( p. R278H),PolyPhen -2预测结果是"可能有害的(possibly damaging ) ”(见图 3A)O PROVEAN 预测结果是
"有害的(deleterious ) ” , SIFT 预测结果是"破坏 性的(damaging )"(见图 3B ) o
2.3.3 蛋白质三级结构预测与分析结果 比
较PANK2基因变异前(c. 833G, p. 278R)(见
图 4A)和变异后(c. 833A, p. 278H )(见 图4B)蛋白质三级结果发现变异前PANK2蛋
白第278位氨基酸与周围多个氨基酸形成氢 键，变异后氢键的数量明显减少，这必然会对
PANK2蛋白的生物学功能产生影响。
2.4 PKAN 临床表型和基因型
查找2020年之前发表的与PKAN 相关的文
献，对具有明确双致病变异位点的病例进行了详
细统计，共发现224个家系中的262例患者。
对于PKAN 已经描述了多种遗传缺陷，但对皮
是在相关文献中存在多种参考序列，甚至存在
部分测序峰图和表述不一致的现象，阻碍了遗
传发现的解释，参考序列NM _153638. 2对变 异进行了校对(见表2)，共发现142个致病性 变异，包括26个缺失致病性变异、5个重复致
病性变异、4个插入致病性变异、8个剪切位点
致病性变异和107个错义致病性变异。
PKAN 具有很强的临床表型异质性，为了明 确临床表型和疾病的相关性，便于临床医生判
断，对每位患者的初始症状进行了统计分析
(见表3)。可以发现肌张力障碍是PKAN 患者 最常见的初始症状(65.7% ) o
根据发病年龄和发病后病情进展将PKAN 划分为典型和非典型两种，典型患者发病年龄 较早，病情进展快速，非典型患者发病年龄较
晚，病情进展较慢，非典型患者的生存质量往
往好于典型患者。为了比较典型患者和非典型 患者的区别对患者的临床表现和基因型进行了
PrMMn Acc Posraon AA, AA ； Descrtpoon
〜… c Reclame Fua.PantotHenMe lana 2 miiocnononai SttoH>nP«nK2 EC-2 7 1 33 Antume FuB*PantomenK acia kana 2 Flags Precursor Lenatn
曰 Humv»r
Th« mutation i» preOKiea to Oe IBLY OAMAOING with ・ score <XO^M (nsttivay O.«3 specitcity 0^1)
VARIATION PROTEIN SEQUENCE CHANGE PROVEAN PREDICTION SIFT PREDICTION
ROW_NO.
INPUT PROTEW_ID POSITION RESHXJe.Rff RESIDUE _AtT SCORE PRW1CTION »SCQ »CLUSTER SCORE PREDICTION H^IAN.IKO *SEQ
(cutoffs-2.S) (cutoff^O.OS)
B 1 Q98Z23 278 R H Q96Z23 27« R H -3.79 Matenous 191 30 0.025 Damagino 2.90 I
石
图 3 PoiyPhen-2、PROVEAN 和 SIFT 预测结果
Fig. 3 Predicted result of p. R278H with PolyPhen-2 .PROVEAN and SIFT softwares
注：A. PolyPhen-2预测结果；B. PROVEAN 和SIFF 预测结果
Note ： A. Predicted result of PolyPhen -2 ；B. Predicted results of PROVEAN and SIFT.
图4蛋白质三级结构预测结果Fig. 4 Predicted result of spatial structure
注：A.野生型PANK2蛋白三级结构(c.833G. p. 278R)；B.变异后PANK2蛋白三级结构(c.833A, p.278H)
Note ： A. Tertiary structure of wild-type PANK2 protein ( c. 833G, p. 278R) ； B. Tertiary structure of variant PANK2 protein ( c. 833 A , p.
278H)
