D13S317基因座“off-ladder”等位基因分析
黄洪武;徐振亮;朱诣琦
【摘 要】目的:确证在DNA数据库构建过程中一样本D13S317基因座出现的稀有分型标准物外off-ladder (OL)等位基因.方法:AGCU 17 +1 STR荧光检测试剂盒进行STR分型时,D13S317基因座检出OL等位基因;利用Chelex-100法提取血样DNA进行荧光PCR,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和ABI 3130电泳检测并由上海生工进行测序.结果:OL等位基因只含有6个[TATC]重复,不在D13S317基因座Allelic Ladder范围之内,是一个新的等位基因.结论:新的等位基因的出现,对扩大DNA数据库的覆盖范围及全面性和提高基因座个体识别能力等具有重要的借鉴意义.
【期刊名称】《沈阳医学院学报》
【年(卷),期】2013(015)004
【总页数】3页(P205-207)
【关键词】D13S317基因座;AGCU 17+1试剂盒;off-ladder等位基因;STR-PCR
【作 者】黄洪武;徐振亮;朱诣琦
【作者单位】江苏省昆山市公安局,江苏昆山215300;江苏省昆山市公安局,江苏昆山215300;江苏省昆山市公安局,江苏昆山215300
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.5
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有高度多态性的遗传标记。其核心序列(重复单位)的重复数目存在差异,一般每个位点有近十个到十几个等位基因，以孟德尔共显性方式遗传，在人类基因组中，大约每隔6～10 kb就出现一个STR位点[1]。STR分型具有检测灵敏度高，适宜微量、腐败降解材料鉴定的优点[2]，凭借其操作简单、便于控制及标准化的技术，成为国内外法医学界关注的焦点及第二代法医DNA分型技术的核心[3-4]。随着STR遗传标记的广泛使用，稀有等位基因的出现逐步增多[5-6]，D13S317是位于人类第13号染色体长臂的简单四核苷酸序列重复的STR基因座，其重复单位为TATC，核心重复次数为7～15次。本研究分析了AGCU 17+1 STR荧光检测
试剂盒进行STR分型时D13S317基因座检出的“off-ladder”(OL)等位基因，对样品进行了单基因座扩增和测序，并确认该基因座等位基因为稀有等位基因。
1 材料与方法
1.1 血样 DNA数据库建设过程中的个体血样。
1.2 主要试剂及仪器 ABI 3130毛细管测序仪(ABI公司)，PCR仪(博日公司)，凝胶电泳系统(北京六一仪器)，Chelex-100(Bio-rad公司)，AGCU 17+1 STR荧光检测试剂盒(AGCU公司)，LB平板培养基，5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶。
1.3 方法 (1)DNA提取：采用Chelex-100法制备基因组DNA[7]。(2)D13S317位点大片段克隆引物设计：F：5′-GCAGGAAATAGATGGGATCAAA -3′，R：5′-AATCTCCTCCTTCAACTTGGG-3′。(3) PCR扩增：在25 μl反应体系中进行，PCR管反应液含2.5×Reaction Mixture 10 μl。20 μmol/L引物混合物0.3 μl，5 U/μl热启动Taq酶0.25 μl，模板DNA 4.0 μl，ddH2O 10.3 μl，冰上操作。扩增程序：95 ℃预变性11 min，94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后60 ℃延伸60 min，扩增产
物于4 ℃保存。(4)PCR产物检测：PCR扩增产物用胶浓度为6%，交联度为5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，垂直型电泳，银染显示电泳谱带。(5)PCR产物TA克隆：PCR扩增产物按Bio-Basic pUCm-T Vector操作手册与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB平板培养基(含氨苄青霉素、IPTG、X-Gal)，37 ℃培养14～16 h，筛选白色阳性克隆菌落。(6)目的克隆筛选：将筛选的阳性克隆培养成菌液进行PCR扩增。菌液PCR扩增体系：在20 μl反应体系中进行，PCR管反应液含2.5×Reaction Mixture 8 μl。20 μmol/L引物混合物0.2 μl，5 U/μl热启动Taq酶0.2 μl，模板DNA 2.0 μl，ddH2O 10 μl，冰上操作。扩增程序：95 ℃预变性11 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后60 ℃延伸60 min，扩增产物于4 ℃保存。(7)电泳检测及测序：扩增产物通过ABI 3130遗传分析仪进行毛细管电泳检测，收集电泳信息，得到含目的等位基因的克隆并送上海生工测序。
2 结果
2.1 D13S317基因座“OL”等位基因分型结果 用AGCU 17+1 STR荧光检测试剂盒进行17个STR位点检测，其中D13S317基因座分型结果中出现等位基因11和一个“OL”等位基因，该OL等位基因在Allelic Ladder(7～15)前约4 bp处出现，见图1。
图1 D13S317基因座“OL”等位基因
2.2 D13S317基因座“OL”等位基因测序结果 D13S317基因座定位于人类染色体13q22-q31，核心重复序列为[TATC]，核心重复次数为7～15次，等位基因片段长度大小范围为165～197 bp。AGCU 17+1 STR荧光检测试剂盒中D13S317基因座的Allelic Ladder含有等位基因8～15。测序结果显示：新发现的OL等位基因只含有6个[TATC]重复，是一个新的等位基因。该等位基因不在D13S317基因座常见基因型范围之内，所以标示为OL峰。见图2。
注：方框部分为荧光检测引物结合区；斜体部分为核心重复区图2 D13S317基因座OL等位基因序列比对结果
3 讨论
通常Allelic Ladder包含大部分的常见等位基因片段[8]，而STR分型过程中碰到基因座位于Allelic Ladder范围之外的即OL等位基因，对分型结果的解读产生影响，这类OL等位基因的形成主要有两种类型：一类是出现在Ladder中的两个等位基因之间；另一类是超出Ladd
er范围[9]。对于OL等位基因的出现，可以通过将扩增产物再次电泳、重新扩增样本或用单基因座引物扩增来确证[10]。本研究利用单基因座引物扩增的方法得到含有一个“正常”等位基因和一个OL等位基因的分型结果。所检测出的OL等位基因在Ladder(7～15)范围之外，小于最小的Allelic Ladder，属于第2种类型。根据样本等位基因的位置与Ladder 中等位基因的大小(bp值)对比得出该OL等位基因在Ladder(7～15)前约4 bp处，大小在161 bp，结合测序技术进行序列分析发现该OL等位基因只含有6个[TATC]重复，推测分型结果中OL等位基因的出现的原因是较低频率的基因，即稀有等位基因的出现。
稀有等位基因是指人群中频率极低的等位基因[11-12]。D13S317基因座位于13号染色体长臂的简单TATC四核苷酸重复，其常见等位基因包含7～15个核心重复序列，也有报道显示存在等位基因5、6、16。研究表明中国人群中D13S317基因座常见等位基因分布为7～14，基因频率分布中等位基因8和11分布处于较高水平[13]，本研究[10]所得出的等位基因为6，在常见等位基因范围之外，属于稀有等位基因。另外，欧阳曙明等[14]对湖南人群D13S317、 D19S433、D21S11[15]、D3S1358、D7S820和FGA等6个基因座的OL等位基因观察与分析，对群体遗传多态性数据进行有效的补充和完善。
PCR检验中常会由于DNA聚合酶发生滑脱，从而导致重复序列中核心序列重复次数的改变而出现突变[16]。本次检出的OL等位基因，经STR-PCR再扩增检测，并经测序获得序列信息，结果具有可重复性，有效地避免了STR-PCR检验中引物结合区变异引起的等位基因丢失进而导致的“假突变”现象，可以确定该稀有等位基因为该个体所特有，是遗传物质遗传过程中染色体畸变或者基因突变的产物[17]。另外STR 基因座在不同群体异质性水平较高，不同人群其等位基因和基因型频率分布有明显的地理差异，尤其是中国人群与美洲人群之间差异特别显著[18-19]。
STR 遗传标记已经在个体识别、亲权鉴定等司法鉴定中发挥着越来越重要的作用，成为全世界法医DNA 实验室运用最广泛的一类遗传标记[20]。
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