第一章基因工程概述
1.什么是基因工程，基因工程的基本流程
基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。
1.分离目的基因
2.限制酶切目的基因与载体
3.目的基因和载体DNA在体外连接
4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养
5.选择、筛选含目的基因的克隆
6.培养、观察目的基因的表达
第二章基因工程的载体和工具酶
1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件
具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
具有合适的筛选标记。
分子量小，拷贝数多。
具有安全性。
2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型
1、自主复制性
2、可扩增性
3、可转移性
4、不相容性
主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒
3. 质粒的构建
（1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源 DNA 片段的装载量。一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。
（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数
（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即 多
克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
4. 什么是人工染色体载体
将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体
5. 什么是穿梭载体
人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。
6.入-噬菌体载体及构建
-DNA为线状双链DNA分子，长度为，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。
1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点
引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性
灭活某些与裂解周期有关基因。
使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现象的发生。
加装选择标记，便于重组体的检测
单链噬菌体DNA载体
过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。
引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列（lacZ’）的乳糖操纵子片段（lac）、组氨酸操纵子片段（his）以及抗生素抗性基因等。
将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色。
（4）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列，使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。
8. II类限制性内切核酸酶的特点
限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleas）是一类能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶。
识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列（靶序列）。
识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。
切割位点的规范性：双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。
同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶。
同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶
同尾酶（Isocandamers）：识别位点不同，但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。
9.甲基化酶
Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一种酶的切口
甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。
甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。
连接酶连接作用的特点:
①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基（-OH），另一条DNA链的5’末
端有一个磷酸基（-P）的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接DNA分子的作用。
②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。
③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick），而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。
⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD＋或ATP）
11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用
DNA聚合酶作用的特点：
要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA。
接受模板指导。
需要有引物（3’羟基）的存在。
不能起始合成新的DNA链。
催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端。
催化DNA的合成方向是5’→3’。
Klenow酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶。分子量为76kDa。
Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。
Klenow酶的基本用途：
修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端，使
之成为平头末端。
以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA
片段进行标记。
用于催化 cDNA 第二链的合成。
用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列。
聚合酶
T4-DNA聚合酶酶的基本特性：
有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性。
在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切。
在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。
在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端
13. 影响连接效率的因素有：
温度（最主要的因素）离子浓度
ATP的浓度( 10 M - 1 M )
连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）
反应时间（通常连接过夜）
插入片段和载体片段的摩尔比
DNA末端性质
DNA片段的大小
14.如何将不同DNA分子末端进行连接
1.相同粘性末端的连接
如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解，两种DNA分子均含有相同的粘性末端，因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子
2.平头末端的连接
T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下，能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。
3.不用粘性末端的连接
3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平
5’端的粘性末端用klenow酶补平，或者用S1核酸酶切平
最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接
