第42卷第2期2021年3月
Vol42No2
Mar&2021
质谱学报
JournalofChine MassSpectrometrySociety
液相色谱-同位素稀释质谱法
测定血清生长激素
余利星12，翟睿2，楚占营2!，金有训2，武利庆2，米薇2,
龚晓云2，谢洁2，江游2，戴新华2，方向2，俞晓平1
!1.中国计量大学生命科学学院，浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江杭州310018；
2.中国计量科学研究院，质谱仪器工程技术研究中心，前沿计量科学中心"匕京100029'
3.华东理工大学化学与分子工程学院，上海200237#
摘要：复杂基质中低丰度蛋白质的准确定量分析一直是蛋白质研究的重点和难点％随着质谱技术的飞速发展，同位素稀释质谱法成为血清中低丰度蛋白质准确定量分析的重要方法％本研究以同位素标记的人生长激素为内标，通过C12和C4色谱柱两次分离收集目标馏分，建立了基于离线二维高效液相色谱分离血清样本的新方法％然后，结合高效液相色谱-同位素稀释质谱法，准确定量了人血清低丰度蛋白质生长激素的含量％通过对模拟样品(空白血清添加已知质量生长激素标准物质，理论含量为12.00ng/g)和国际比对样品中生长激素(浓度未知)的测量及不确定度计算，定量结果分别为
(11.45+2.33)ng/g和(12.84+1.46)ng/g%该方法准确性高、重复性好，为复杂基质低丰度蛋白质
的准确定量分析提供了一种有效的测量方法和可溯源的分析结果％
关键词：血清；生长激素；高效液相色谱(HPLC)；同位素稀释质谱法(IDMS)；定量分析
中图分类号:O657.63文献标志码:A文章编号：1004-2997(2021)02-0129-11
doi：10.7538/zpxb.2020.0025开放科学(资源服务)标识码(OSID):
Determination of Serum Growth Hormone
by Liquid Chromatography-Isotope Dilution Mass Spectrometry
YU Li-xing12,ZHAI Ri,CHU Zhan-ying2",JIN You-xun2,WU Li-qing2,
MI Wei2,GONG Xiao-yun2,XIE Jie2,JIANG You2,
DAIXin-hua2FANG Xiang2YU Xiao-ping1
(1.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology an,Inspection&Quarantine,
College of Life Sciences,China Jiliang University,Hangzhou310018,China；
收稿日期：2020-02-29；修回日期：2020-04-28
基金项目：国家重点研发计划项目(2016YFF0200504,2016YFF0200502,2017YFF0106001,2018YFF0212503)；国家自然科学
基金项目(21575132)；重大科学仪器设备开发项目(2016YFF0102603)资助
作者简介：余利星(1993-)，男(汉族)，浙江人，硕士研究生，生物化学与分子生物学专业％E-mail:178****************
通信作者：翟睿(1986—)，女(汉族)，黑龙江人，副研究员，从事重大疾病生物标志物研究。E-mail:**************
方向(1963—)，男(汉族)，湖南人，研究员，从事物质量测量技术、质谱理论及仪器工程技术研究％
E-mail:fangxiang@
俞晓平(1963—)，男(汉族)，浙江人，研究员，从事生物安全与控制研究％E-mail：************
130质谱学报第42卷
2.Center for Advanced Measurement Science,Bass Spectrometry Engineering Technology Rearch Center,
Cational Institute of Metrology,Beijing100029,China；
3.SchoolofChemistryand BolecularEngineering"
East China University of Science and Technology,Shanghai200237,China)
Abstract:The accurate and quantitative analysis of low-abundance proteins in complex matrices has always been the focus and faced di f iculty in protein rearch Withthe rapiddevelopmentofmassspectrometrytechnology,isotopedilutionmassspectrometry hasbecomeanimportant methodforaccuratequantitativeanalysisoflow-abundance proteinsinrum Inthisstudy,isotopica l ylabeledhumangrowthhormonewasud asaninternalstandard A strategy for paration of rum samples wastablished bad on off-line two-dimensional high-performance liquid chromatography(2D HPLC).
Then,combined with high performanceliquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry IDMS)method,quantitative analysis of low-abundance protein growth hormone!hGH)in human rum was performed with high accuracy Bad onthe measurement and uncertainty calculation of the simulated samples!blankrum with knownqualityofgrowthhormonestandardsubstance,theoreticalconcentration12.00 ng/g)and internntionBl comparison samples,the quantitative results are(11.45+2.33) ng/g and(12.84+1.46)ng/g,respectively.This method has high accuracy and good repeatability,andcanprovideane f ectivemeasurementmethodforaccuratequantitative analysisoflow-ab
undanceproteinsincomplex matrices Theresultscantracetorefer-encematerial
Key words:rum；growth hormone；high performance liquid chromatography !HPLC)'isotopedilution massspectrometry IDMS)'quantitativeanalysis
临床体外诊断生物标志物中，蛋白质类标志物广陵散古琴曲
约占10%〜15%+1\目前，针对蛋白质的检测方法有时间分辨荧光免疫分析法+23、酶联免疫吸附法4、LC-MS/MS法、免疫散射比浊法7和毛细管电泳结合紫外、质谱技术⑷等，其中基于抗原一抗体反应的免疫分析法是临床蛋白质定量分析应用最广泛的方法卩11%然而，由于存在抗体特异性差异、蛋白质结合位点差异、基质干扰、假阳性结果等问题，很难得到准确可靠的蛋白质定量分析数据，造成不同国家、不同实验室蛋白质定量分析结果不可比对，临床诊断准确性无法保证[1213]%因此，建立高准确度的蛋白质定量分析方法是必要的％
同位素稀释质谱法(isotope dilution mass spectrometry，IDMS)具有准确性高、重现性好等特点，已成为蛋白质质谱定量分析的首选方法+1-6%该方法将已知质量的同位素标记肽段或蛋白质作为内标加入待测样本中，通过质谱仪测定同位素丰度比例，从而计算目标蛋白质含量％然而，以同位素标记肽段为内标的方法，由于标记肽段添加时间较晚，且理化性质与目标蛋白质相差较大，由蛋白质降解、酶切不完全以及蛋白样品损失带来的定量误差无法避免+17%因此，以同位素标记蛋白质作为内标的方法是更可靠的%
内分泌疾病是内分泌腺或内分泌组织本身的分泌功能和(或)结构异常时发生的症候群，目前已成为严重威胁人类健康的慢性疾病。临床上，内分泌疾病的预防、诊断和治疗主要依赖相应诊断标志物的准确测量+18%人生长激素(human growth hormone,hGH)是由人体脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种蛋白质类激素，由191个氨基酸构成，其主要生理功能是促进组织生长、全身蛋白质合成、脂肪分解等，是肢端肥大症、巨人症、侏儒症等疾病临床
第2期 余利星等：液相色谱-同位素稀释质谱法测定血清生长激素131
诊断的重要指标「19「22
，人血清中生长激素正常
值为：成年男性V 2 #g/L 、成年女性V 10 #
g/L , 儿童V 20#
g/L 「23,目前，hGH 的检测方法主
要是基于抗原-抗体反应原理的免疫分析方 法「2"，然而由于受到抗体特异性、测量准确性
和重复性的限制，该方法的重复性不理想，易出 现假阳性结果，无法满足人们对蛋白质高准确
度测量的需求。
由于血清中成分复杂，hGH 含量极低，并
且存在大量高丰度蛋白质的信号干扰［26-28］
，使 得血清中hGH 的直接分析存在困难。在质谱
分析前，发展有效的分离纯化方法是血清中生 长激素准确定量分析的关键。本研究拟以同位
素标记的人生长激素为内标，建立一种基于离 线二维高效液相色谱分离蛋白质酶切样品的方 法。该方法通过应用高低pH 流动相实现不同
性质血清酶切肽段的有效分离，从而降低血清 样品的复杂程度，提高hGH 定量肽段的质谱 响应。最后，结合高效液相色谱-同位素稀释质
谱法（HPLC-IDMS ）准确定量分析血清中hGH 含量，其流程图示于图1，并应用建立的方法参 加国际比对（CCQM-P164）O
1实验部分
1.1仪器与材料
Agilent 1260高效液相色谱仪：美国Agilent
公司产品，配有G1311C 四元泵、G1314F 紫外
检测器和液相色谱系统化学工作站;Agilent
1200/API 5500液相色谱-质谱联用仪：美国 Agilent 公司/美国AB Sciex 公司产品，配有电
喷雾离子源（ESI ）及Analyst 数据处理软件;
ME235S 分析天平：德国赛多利斯集团产品;
VORTEX GENIE2 混匀仪：美国 Scientific Industries 公司产品；MiHi-Q 超纯水系统：美国
Millipore 公司产品；真空离心浓缩仪：美国
Thermo 公司产品％
人生长激素标准品（WHO 国际标准品）：英
国NIBSC 公司产品；二硫苏糖醇（DTT，纯度$
99% ）、胰蛋白酶（纯度$99% ）、乙腈（色谱纯）：
美国Sigma 公司产品；空白血清：美国NIST 公
司产品；国际比对人生长激素标准品（6. 57 #g/g ）、 国际比对同位素标记人生长激素标准品（8.30
#g/g ）、国际比对空白血清、国际比对样品：由
德国联邦物理技术研究院提供;Tris-碱（Tris -
Ba，纯度$99% ）：福州Phygene 公司产品； Tris -酸（Tris-HCl ，纯度〉99.5% ）：上海索宝
生物科技有限公司产品；甲酸（FA ）、三氟乙酸
（TFA ）、乙酸：均为LC-MS 级，美国Thermo
Fisher 科技有限公司产品；氨水（NH 3・比0,
浓度25% ）：东莞泰鑫化工有限公司产品；hGH
定量特异性肽段（T2、T11和T12）及其标记肽 段：吉尔生化有限公司产品；模拟样品（理论含 量12. 00 ng/g ）：空白血清添加已知质量生长
激素标准物质％
T2、Til 、T12、、T2* Til* T12*
模拟样品或 国际比对样品模拟样品或 国际比对样品
Til 、 T11*
T12、 T12*
T2 T2*
校准样品
一维液相分离LC-MS/M榛子怎么吃
S
二维液相分离
空白血清、
hGH 标准品、 占-hGH 标准品
模拟样品或 国际比对样品、 占-hGH 标准品
T11T11*
校准样品
胰蛋白酶切
T2、Til 、T12、\ T2*、Tll*、T12y T12---------------T12*
图1血清中hGH 的测定流程
Fig. 1 Chart of method flow of租房证明
hGH in rum
T2T2*
I
九
A
k
A
A JL
A
A
132质谱学报第42卷
1.2实验方法
1.2.1标准品制备使用空白血清稀释生长激素(hGH)标准品和同位素标记生长激素(L-hGH)标准品，轻轻混匀1h，分装后保存于-80e冰箱，备用％
I.2.2校准样品和血清样品的制备将500 #L空白血清与1.2.1节配制的hGH和L-hGH标准品混合，制成校准样品％其中，校准样品1为含有11.95ng/g hGH标准品和II.60ng/g L-hGH的血清溶液，用于模拟样品
的分析；校准样品2为含有17.29ng/g hGH 标准品和17.32ng/g L-hGH的血清溶液，用于国际比对样品的分析％
将500#L血清样品(模拟样品或国际比对样品)与上述配制的L-hGH标准品混合制备待分析的血清样品，待分析的血清模拟样品中L-hGH的添加质量与hGH的理论质量相等％
1.2.3胰蛋白酶酶切称取302.5m g TrisBa和395mg Tris-HCl溶于1mL纯水中，配制Tris溶液；称取12mg胰蛋白酶溶于1.8 mL50mmol/L HAc中，配制胰蛋白酶溶液%取65#L Tris溶液至校准品和样品中，混匀后逐滴加入50#L胰蛋白酶溶液(pH值为&2+ 0.2)，然后每隔30min逐滴加入100#L乙腈溶液，共11次，从30min起，每隔60min滴加50#L胰蛋白酶溶液，共5次将校准品和样品在37e环境中孵育16h%
在校准品与样品中加入3.2mg DTT，于37e轻摇1h，以17860r/min离心10min，吸取上清液％加1mL水-乙腈溶液(50:50, V/V)于沉淀中使其溶解，以17860r/min离心10min后，合并上清液，然几个月宝宝会爬
后将上清液置于真空离心浓缩仪中浓缩干燥％加入400#L去离子水至浓缩干燥的校准品与样品中，涡旋，加入100#L16%TFA溶液，涡旋％以3960r/min 离心10min，吸取上清液，加入300#L去离子水洗涤沉淀，以3960r/min离心10min后，合并上清液，备用%
1.3实验条件
1.3.1离线二维高效液相色谱条件一维液相色谱条件:Jupiter Pro计算机病毒分类
teo色谱柱(RP-C12, 9nm,4#m,250mm X10mm)；流动相：A为含0.1%TFA的水溶液，B为含0.1%TFA的乙腈，流速2mL/min；洗脱梯度：0〜1min(0〜1%B),1〜5min(1%B),5〜80min(1%〜80%B), 80〜90min(80%B),90〜90.5min(80%〜1%B), 90.5〜120.5min(1%B)。
二维液相色谱条件:Jupiter C4色谱柱(30nm,5#m,250mm X10mm)；流动相: A为含0.05%FA的水溶液，使用NH3-H Z O 溶液(浓度25%)调至pH8.0+0.1,B为含0.05%FA的乙腈，使用NH3-H Z O溶液(浓度25%)调至pH80士0.1。使用500#L流动相A复溶一维液相分离得到的干燥馏分。复溶后上样，流速2mL/min，洗脱茯苓的食用方法
梯度为0〜5 min(0%B),5〜80min(0%〜60%B),80〜85 min(60%B),85〜85.5min(60%〜0%B), 85.5〜115.5min(%B)%
1.3.2高效液相色谱条件色谱柱:Aeris Peptide XB-C18色谱柱(250mm'
2.1mm X
3.6#m,Phenomenex)；进样体积20#L；流速200#L/min；流动相:A为含0.1%FA的水溶液，B为含0.1%FA的乙腈；洗脱梯度：0〜6 min(100%〜98%A),6〜15min(98%〜91%A), 15〜60min(1%〜70%A)%
1.3.3质谱条件电喷雾离子源，喷雾电压4.2kV，多反应监测模式(MRM)%T11和T11&、T12和T12&的碰撞能量为20eV，去簇电压为50V；T2和T2&的碰撞能量为22eV，去簇电压为50V%监测离子:T2为m/z490.4' 719.4,T2&为m/z496.23'729.32；T11为m/z 681.5'875.5,T11&为m/z689.3'887.4；T12为m/z387.4'531.4,T12*为m/z39
2.19'539.23%
2结果与讨论
2.1一维色谱分离(C12色谱柱)
血清样品经酶切处理后产生大量肽段，样品成分极其复杂，质谱分析中高丰度蛋白质的酶切肽段将严重抑制hGH定量肽段的质谱信号％为了降低血清酶切样品复杂程度，提高低丰度蛋白质的定量准确性，需建立新的有效分离纯化方法，以实现hGH定量肽段的收集和分析％首先，化学合成用于生长激素准确定量分析的特征肽段T2(LFDNAMLR,Mr=979.15)、T11(DLEEGIQTLMGR,Mr=1361.52)、T12
第2期余利星等：液相色谱-同位素稀释质谱法测定血清生长激素133
（LEDGSPR，Mr=772.8）及相应的同位素标
记肽段T2&、T11&和T12&皿。然后，在低
pH值流动相条件下，进样合成肽段纯品（100
#g/L）%经高效液相色谱分离检测后，T2和
T2&、T11和T11&、T12和T12&的保留时间
分别为38〜39,41.5〜42.5、25〜26min，示于
图2%因此，在低pH值流动相条件下，血清样
品酶切后经第一次高效液相色谱分离时
（图3），馏分收集器收集38〜39min时的馏分（含警句
有肽段T2和T2&）,41.5〜42.5min时的馏分（含有肽段T11和T11&）和25〜26min 时的馏分（含有肽段T12和T12&），将收集的馏分浓缩干燥，加入200#L乙腈-水溶液（80: 20,V/V），复溶后浓缩干燥，用于第二次高效液相色谱分离（高pH值流动相）%
//min
注：1.肽段T12,25.547min；2.肽段T2,38.315min；
3肽段T11,41.943min
图2T2、T11和T12肽段经高效液相色谱
(低pH值流动相)分离的色谱图
Fig.2Chromatogram of peptide T2,T11and T12 parated by high performance liquid
chromatography(low pH mobile pha)
n
v
u
l
'
w
u
曰
s
-1000 -1000
—1500卜
020406080100120
//min —1500卜
020406080100120
//min
注：a.模拟样品；b.国际比对样品
图3血清样品酶切后经高效液相色谱(低pH值流动相)分离的色谱图Fig.3Chromatograms of a digested rum sample parated by high performance liquid chromatography(low pH mobile pha)
2.2二维色谱分离（C4色谱柱）
为进一步分离纯化血清酶切样品，降低定量分析时杂质肽段的质谱信号干扰，目标馏分需再次经过高效液相色谱分离（高pH值流动相）。使用C4色谱柱在高pH值流动相分离后收集含有肽段T2&T11和T12的馏分%首先，在高pH值流动相条件下，将浓度为100#g/L的T2、T11和T12肽段及相应的同位素标记肽段进样到色谱系统%在C4色谱柱上，T2和T2&、T11和T11&、T12和T12&的保留时间分别为55.3〜5除非英语
6.3、51〜52、20.5〜21.5min，示于图4%在高pH值流动相条件下，血清酶切样品经高效液相分离，其色谱图示于图5%馏分收集器收集55.3〜56.3min 时的馏分（含有肽段T2和T2&）,51〜52min 时的馏分（含有肽段T11和T11感谢老师作文
&）和20.5〜21.5min时的馏分（含有肽段T12和T12&），分别加入100#L FA-H2O溶液（5：95, V/V），真空浓缩干燥后用于后续质谱定量分析％血清酶切样品经不同pH值流动相的色谱纯化后，有效分离了不同性质的肽段，同时去除了大量杂质肽段，降低了样品的复杂程度，显著提高了hGH定量肽段的质谱信号强度％建立的基于离线二维高效液相色谱分离纯化新方法是血清中生长激素准确定量分析的前提
%
