doi：10.3969/j.issn.l000484X.2021.03.012
-免疫学技术与方法•
荧光定量PCR用于hTRIMCyPA抑制HIV-1的研究①
吉梦梦孟祥平冯小倩徐欣欣张玉清秦宇
(河南科技大学医学技术与工程学院，洛阳471000)
中图分类号R392-3R-331文献标志码A文章编号1000-484X(2021)03-0325-05
[摘要]目的：建立相对荧光定量PCR测定HIV-1晚期反转录产物方法，并以其评价hTRIMCyPA对HIV-1的抑制作用。方法：选择HIV-1的LTR区和HIV-lGag之间的序列设计晚期反转录产物引物，以GAPDH基因为内参基因，建立SYBR Green I相对荧光定量PCR测定HIV-1晚期反转录产物的体系，并用来评价hTRIMCyPA重组蛋白对HIV-1晚期反转录产物的影响。结果：在建立的荧光定量PCR体系中，晚期反转录产物和内参GAPDH标准曲线的斜率分别为-3.381,-3.289。相关系数R2分别为0.9929,0.9937，均>0.99，表明二者的线性较好，晚期反转录产物基因及参照基因GAPDH基因扩增效率相同，可用于相对定量分析「hTRIMCyPA表达组HIV-1相对晚期反转录产物量明显少于空载体组。结论：本研究建立的定量HIV-1特异性反转录产物相对荧光定量PCR检测方法简单、高效和成本低廉，并且hTRIMCyPA对HIV-1
反转录具有明显抑制作用。
[关键词]TRIM5；HIV-1；荧光定科技的发展
量PCR；晚期反转录产物；基因组
Fluorescence quantitative PCR assay for inhibition of HIV-1by hTRIMCyPA
JI Meng-Meng,MENG Xiang-Ping,FENG Xiao-Qian,XU Xin-Xin,ZHANG Yu-Qing,QIN Yu.Medical Technology and Engineering College of Henan University of Science and Technology,Luoyang471000,China
[Abstract]Objective:To establish a relative fluorescence quantitative PCR method for the determination of late rever transcription products(late RT)and u this method to study the inhibitory effect of hTRIMCyPA on HIV-1.Methods：The quence between the LTR region of HIV-1and the Gag conrved region was lected to design the primers for the late RT to establish the SYBR Green I relative fluorescence quantitative PCR system with the GAPDH as a reference for the determination of the late RT of HIV-1, and to evaluate the effect of hTRIMCyPA protein on the late RT of HIV-1.Results:The correlation coefficients R2of the late RT and the GAPDH standard curve in the established fluorescence quantitative PCR system were0.9929and0.9937with the slope were -3.381,-3.289,respectively.The correlation coefficient R2>0.99of the two standard curves 辞职怎么说
indicates th
at the two are well linear,and the amplification efficiency of the late RT and the GAPDH gene is the same,which can be ud for relative quantitative analysis.The amount of HIV-1late RT in hTRIMCyPA gene expression group was significantly lower than that in empty vector group.Conclusion: The relative fluorescent quantitative PCR detection method established in this study has the advantages of simplicity,efficiency,and low cost,hTRIMCyPA significantly inhibits HIV-1rever transcription.
[Key words]TRIM5琢；HIV-1；Fluorescence quantitative PCR;Late RT；Genome
HIV-1是反转录病毒科慢病毒属成员，它的基因组是双正链RNA，主要侵犯人体的CD4+T淋巴细 胞和巨噬细胞。当HIV-1进入宿主细胞后，其正链RNA开始反转录合成双链DNAo HIV-1反转录的过程一般包括以下步骤：①负链强终止DNA
①本文受河南省自然科学基金项目(182300410328)；河南科技大学
SRTP基金资助项目(2019360)资助。
作者简介：吉梦梦，女，主要从事医学检验研究。
通信作者及指导教师：孟祥平，男，博士，讲师，主要从事分子病毒学
方面的研究,E-mail:。(-sssDNA)的合成;②长负链DNA的合成;③正链强终止DNA(+sssDNA)的合成;④完整的双链DNA 合成［1］。最后合成的完整DNA两端含有LTR序列，又叫HIV-1晚期反转录产物(HIV-1late RT)，因此在检测反转录过程完整的DNA双链时，应当检测LTR/Gag序列［2］。反转录过程是HIV-1病毒复制的关键环节，已成为研发抗HIV-1药物的重要靶点［3］。恒河猴TRIM5琢属于三重基序蛋白(tripartite motif protein,TRIM)大家族的成员，通过多种机制抑制HIV-1，而人的TRIM5琢作用较弱［4-8］。将人TRIM5琢中结合衣壳蛋白的B30.2(SPRY)结构域用
同样结合衣壳蛋白的亲环素A(CyPA)代替，构建人源的hTRIMCyPA以避免异种蛋白的免疫排斥反应。因此推测hTRIMCyPA也能特异识别并结合HIV-1衣壳蛋白，并影响衣壳蛋白的脱壳，抑制病毒的RNA反转录成DNA［4-5］。虽然临床有效的抗反转录病毒治疗(HAART)提高了艾滋病的临床疗效，但因HIV-1的高度变异性和潜伏感染，存在药物疗效不佳和毒副作用大的问题［9-10］。因此，本研究采用假病毒系统建立一种可分析感染细胞内病毒生命周期早期特异性DNA产物的相对荧光定量PCR技术，并以其评价hTRIMCyPA对HIV-1的抑制作用。这对于未来抗HIV-1相关病毒新药的研发具有重要的意义。
1材料与方法
1.1材料蛋白酶K、DNa I购自Sigma公司；SYBR Green Master Mix(Low Rox)购自上海翊圣生物科
技有限公司;EZTrans细胞转染试剂购自上海李记生物；荧光素酶检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；兔抗GFP和内参GAPDH多克隆抗体购自上海生工生物公司；hTRIMCyPA基因表达质粒hT-RIMCyPA/pcDNA3.1EGFP由本实验室构建，pNL4-3LucR-E-由徐建青教授惠赠,HEK293细胞、HEK293t 细胞、pMD
2.G、pcDNA
3.1和pcDNA3.1EGFP载体由本实验室保存。
1.2方法
1.2.1PCR引物的设计与合成引物由premier5.0软件设计，由上海生工生物公司合成。HIV-1晚期反转录产物基因引物的设计：参考pNL4-3LucR-E-的序列，选择HIV-1的LTR区和HIV-1Gag之间的序列设计晚期反转录产扣篮英文
物引物，设计合成引物如下：LTRGag F：5'-TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT-3',R：5'-GAGTCCTGCGTCGAGAGATC-3'。作为内参基因的GAPDH基因引物如下：GAPDH F:5'-CAAGGCTGT-GGGCAAGGTC-3',R：5'-TGGAGGAGTGGGTGTCGCT-3'。
1.2.2HIV-1假病毒包装在包装的前一天进行铺板，待HEK293T细胞生长至约80%汇合度时，将质粒pMD2.G和pNL4-3LucR-E-以1:3的比例联合转染到细胞中，转染按照EZTrans细胞转染试剂说明书操
作进行。转染6h后换液，48h和72h各收集全部上清,800g离心5min以去除细胞碎片，用0.45滋m的滤器过滤，分装后保存备用。
1.2.3hTRIMCyPA的表达及Western blot鉴定将hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP及pcDNA3.1转染HEK293细胞，第二天在荧光显微镜下观察hTRIMCyPA的表达,48h后，吸去培养液，用1ml预冷的PBS洗1次，吸去PBS，再用碧云天的IP及Western细胞裂解液(含1mmol/L PMSF)裂解并收获细胞，蛋白样品经12%SDS-PAGE后，转移至PVDF膜，封闭后,5%脱脂牛奶封闭1h后，分别加入Anti-EGFP及内参GAPDH多抗4益孵育过夜，洗膜后加入偶联HRP的羊抗兔二抗，室温孵育2h，洗膜后进行ECL显色。
1.2.4假病毒感染实验将1.2.3转染hTRIMCyPA/ pcDNA3.1EGFP及pcDNA3.1的细胞作为感染靶细胞，每组3个复孔。转染前弃去培养基，每孔加入500滋l含2ng p24的假病毒，假病毒事先在37益下10mmol/L MgCl2中的用DNa I(20U/ml)预处理病毒1h以除去残存的质粒DNAo为提高感染效率，加入1滋g/ml的polyl rene。6h后，用 PBS洗3次以去除残留未感染的假病毒。再继续培养至48h，使用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性以确认是否感染成功。
1.2.5细胞中总DNA的提取 1.2.4操作至用PBS洗3次去除残留未感染的假病毒后，在24孔香葱煎蛋
板中直接加入600滋l细胞裂解液(1.5mmol/L pH8.0 Tris-HCl,50mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl, 0.45%Np-40,0.45%
Tween20)充分裂解，混匀后加入蛋白酶K(终浓度为100滋g/ml),55益过夜或57益3h,95益15min水浴灭活蛋白酶K,4益, 12000g离心5min取上清作为待测样品。
1.2.6SYBR Green I荧光定量PCR方法建立
按照SYBR Green I荧光PCR试剂盒说明书操作, 20滋l反应体系：2xSYBR Green I Mixture10.0滋l, 10滋mol/L Forward Primer0.4滋l,10滋mol/L Rever Primer0.4滋l,Template DNA1滋l，加ddH2O 至20滋l。循环条件：95益5min；95益10s；58益40s,40个循环；58益1min退火阶段采集荧光信号。绘制标准曲线：取hTRIMCyPA组所提取的基因组DNA进行2倍梯度稀释，做7个梯度，分别用内参引物和目的基因引物进行扩增。仪器自动绘制出对应于内参基因和目的基因的标准曲线。所有试验样品均设3次重复。采用2-AACt计算HIV-1反转录产物的相对表达量，用内参基因校准目的基因表达。
1.3统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行，结果以xs表示，两组数据采用t检验分析，多组均数采用方差分析，检验水准琢=0.05o
2结果
2.1hTRIMCyPA的表达及Western blot鉴定将
hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP和pcDNA3.1空载体质粒用EZTrans细胞转染试剂转染HEK293细胞。第
二天用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，发现转染hTRIMCyPA孔出现明显的绿色荧光（见图1B），而对照孔没有绿色荧光表达（见图1A）o hTRIMCyPA与载体中的EGFP融合，因此可以判断hTRIMCyPA表达成功。为进一步确定该蛋白的表达，将hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP或pcDNA3.1空载体质粒转染试剂转染HEK293细胞,48h后裂解细胞进行Western blot检测，由于hTRIMCyPA与EGFP融合，因而hTRIMCyPA对应的孔出现条带而空载体组及空白细胞对照组均没有条带（见图2），进一步说明hTRIMCyPA成功表达。
2・2假病毒感染荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，结果发现转染后2组的荧光素酶活性明显高于空白细胞对照组。hTRIMCyPA组的荧光素酶活性低于空载体组转染组（见图3），说明HIV-1假病毒颗粒感染成功，并且hTRIMCyPA具有抑制HIV-1的作用。
2.3荧光定量PCR检测体系的建立在QuantStu-dio3型荧光实时PCR检测仪上结束扩增后，由系统软件分析，以初始模板的对数为x轴，以Ct值为y 轴作回归曲线，自动生成标准曲线。其中HIV-1late RT标准曲线（见图4A）的相关系数R2为0.9929。
PCDNA3.1hTRIMCyPA
图1hTRIMCyPA表达的荧光显微镜检测
Fig.1Detection of hTRIMCyPA expression by fluorescence microscopy
23
IB GFP81kD hTRIMCyPA
IB GAPDH■■b*36kD GAPDH
图2hTRIMCyPA的Western blot鉴定图
Fig.2Result of hTRIMCyPA protein by Western blot analysis
Note: 1.Untransfected group； 2.pcDNA3.1transfected group；
3.hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP transfected group. 斜率为-3.381，标准曲线回归方程为:y=-3.381x+ 27.208o内参GAPDH标准曲线（见图4B）相关系数R2为0.9937o斜率为-3.289，标准曲线回归方程为：y=-3.289x+25.307。二者的斜率相差低于0.1，表明二者扩增效率一致，可用于接下来的相对定量分析。相关系数R2>0.99，表明两标准曲线线性较好，能够准确定量。
2.4各样品相对定量分析结果利用本试验建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法对假病毒感染的hTRIMCyPA表达的样本组的抑制效果见图5o可见hTRIMCyPA组HIV-1相对late RT量明显少于空载体组，李白浪漫的诗句
有统计学意义。
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HEK293pcDNA3.1hTRIMCyPA
图3假病毒感染HEK293细胞后的荧光素酶活性分析Fig.3Lucifera activity in HEK293cells after HIV-1 pudovirus infection
Note:*.P<0.05vs HEK293；#.P<0.05vs pcDNA3.1.
图4
Fig.4
Note：A.
HIV-1late RT和GAPDH基因标准曲线
Standard curve of HIV-1late RT and GAPDH
HIV-1late RT；B.GAPDH.
pcDNA3.1hTRIMCyPA
图5
Fig.5
Note:*
HIV-1假病毒感染后各组HIV-1late RT产物的相
对量
Relative HIV-1late RT in each group after HIV-1
pudovirus infection
.P<0.
05.
3讨论
荧光定量PCR克服了常规PCR只能定性不能定量的技术难题，其包括绝对和相对两种定量方法。绝对定量法需要克隆相关的基因以构建相应表达载体作为标准品用于构建标准曲线，并且每次试验均要制作标准曲线，增加了实验的复杂度。本研究以SYBR Green I作为荧光标记物，不需要设计昂贵的探针，因而成本相对较低。为了验证目的基因和内参基因扩增的Ct值与拷贝数的相关性，本研究建立了各自标准曲线加以验证。在实时定量中，只要将待测样品中的任何一个作为“相对标准品”，系列稀 释后用于构建标准曲线，即可获得斜率并验证方法的可行性[11-12]。这无疑降低了实验的工作量和复杂性。
本研究所设计的HIV-1late RT引物，上游处于LTR序列，下游处于Gag前端，扩增出LTR/Gag序列代表连续完整的HIV-1序列。若把引物设计在Gag或Luc等部位，扩增出来的片段不能够代表完整片段，很可能包含一些中间片段，部分是中间合成的长负链DNA产物。本次研究也曾用Gag或Luc 等部位设计的引物进行扩增，发现其PCR产物的量明显大于LTR/Gag引物扩增的量，原因是这个引物扩增的产物含有很多不完整片段，因而不能真正反映完整HIV-1反转录产物量，也不能代表HIV前病毒量[2，13]。据报道,ZACK等[14]利用PCR检测受激和静息状态人类T淋巴细胞中HIV-1的反转录过程时，发现R/U5
序列、U3序列和U3/R/U5-PBS之间序列所扩增出的代表初始反转录片段产物数量几乎相同，但受激T细胞中LTR和Gag之间扩增出的代表完整DNA片段数量明显多于静息细胞，所以选择扩增的LTR/Gag连续序列，能够比较真实地反映HIV-1的反转录情况及病毒活性。
对于HIV-1DNA的提取一般参考基因组的提取方法，一般采用带有DNA吸附柱的试剂盒提取或酚/氯仿抽提DNA法提取[15-16]。这2种方法一般要经过多次转管和离心沉淀，但是HIV-1转录后不会马上整合到庞大而复杂的染色体上，有一部分最先还是些非整合的线形或环状双链DNA分子，通常称为赫特(Hirt)DNA，因此有特定的提取方法[17-18]。在经过多次转管和离心沉淀后，这些散在的DNA可能并不一定和染色体基因组同比例的丢失，因而容易造成DNA得率较低以及实验的重复性差。而直接用细胞裂解液处理后直接PCR在一定程度上能避免这个问题，同时也降低了实验的工作量。目前直接PCR已经在基因组的PCR扩增中得到了广泛的应用，与用试剂盒提取以及其他方法相比，无论是扩增质量还是效率等都具有明显的优势[19-20]。
本研究所用的pNL4-3LucR-E-HIV-1假病毒载体，因其基因序列中的膜蛋白基因被失活，需要与膜蛋白基因质粒共转染才能包装出子代假病毒，由此包装的假病毒由于仅具有单次感染能力而十分安全；另外，由同一外源质粒表达所提供的膜蛋白可产生均一的假病毒颗粒，因而实验的可重复性得到保证，这样就避免了HIV-1活病毒反复传代变异而导致的重复性差的问题[21]。有研究报道，用假病毒来进行药物筛选与同时用活病毒筛选结果一致，从而大大提高了药物筛选的通量和安全性[22-23]。利用本研
究建立的方法已经成功筛选了多个抗病毒药，并对其机制进行了研究。因而本研究建立的测定HIV-1特异性反转录产物的荧光定量PCR的方法具有简单、高效和成本低廉等优点，可用于抗病毒药物机制研究和药物筛选。
致谢：感谢河南科技大学大学医学技术与工程学院段万理、张克兰和秦怡帆同学，河南科技大学大学医学院马甜和余冯同学在实验过程中给予的帮助。
参考文献：
[1]姚文雪，吴英良，郭颖.HIV-1逆转录过程及应用PCR检测
[J].药学学报,2008,43(2)：118-122.DOI：10.3321/j.issn：
0513-4870.2008.02.002.
[2]BUTLER S L,HANSEN M S,BUSHMAN F D.A quantitative
assay for HIV DNA integration in vivo[J].Nat Med,2001,7(5): 631-634.DOI：10.1038/87979.
[3]李艳丽，郑永唐，肖伟烈，等.利用假病毒技术研究抗HIV-1
药物的作用机制[J].微生物学通报,2011,38(10)：15071517.DOI：10.13344/j.microbiol.china.2011.10.014.
[4]STREMLAU M,OWENS C M,PERRON M J,et al.The
cytoplasmic body component TRIM5alpha好看的二次元图片
restricts HIV-1infe网络推广方案
ction in old world monkeys[J].Nature,2004,427(6977):848853.DOI：10.1038/nature02343.
[5]STREMLAU M,PERRON M,LEE M,et al.Specific recognition
and accelerated uncoating of retroviral capsids by the TRIM5alpha restriction factor[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(14)：
5514-5519.DOI：10.1073/pnas.0509996103.
[6]ANDERSON J L,CAMPBELL E M,WU X,et al.Proteasome
inhibition reveals that a functional preintegration complex intermediate can be generated during restriction by diver TRIM5 proteins[J].J Virol,2006,80(19)：9754-9760.DOI：10.1128/ JVI.01052-06.
[7]SAKUMA R,NOSER J A,OHMINE S,et al.Rhesus monkey
TRIM5alpharestricts HIV-1production through rapid degradation of viral Gag polyproteins[J].Nat Med,2007,13(5)：631-635.
DOI：10.1038/nm1562.
[8]LCHIL P D,QLINLAN B D,CHAN W T,et al.TRIM E3ligas
interfere with early and late stages of the retroviral life cycle[J].
PLoS Pathog,2008,4(2)：1-13.DOI：10.1371/joumal.ppat.0040 016.
[9]JOHNSON M O,CHARLEBOIS E,MORIN S F,et al Perceived
adver effects of antiretroviral therapy[J].J Pain Symptom Manage,2005,29(2):193-205.DOI：10.1016/j.jpainsymman.
2004.05.005.
[10]CANE P A.New developments in HIV drug resistance[J].J An-
timicrob Chemother,2009,64(S1)：37-40.DOI：10.1093/
jac/dkp258.
[11]张驰宇，徐顺高，黄新祥.一种新颖简便的荧光实时RT-PCR
相对定量方法的建立[J].生物化学与生物物理进展,2005,
32(9)：883-888.DOI:10.332^^j.i ssn:1000-3282.2005.09.013. [12]王国强，王玮，洪楚原.实时荧光定量PCR检测IGFBP4在
胃癌组织中的表达[J].临床医学工程,2012,19(6):879-
881.DOI：10.3969/j.issn.1674^659.2012.06.0879.
[13]莫雪梅，闫莉，孙晗笑.SYBR Green I荧光定量PCR检测
HIV-1前病毒方法的建立及应用[J].山东医药，2010,50
(23)：10-12.DOI：10.3969/j.issn.1002-266X.2010.23.004.
[14]ZACKJ A,ARRIGO S J,W'EITSMAN S R,et al.HIV-1entry into
quiescent primary lymphocytes：molecular analysis revealsa
labile,latent viral structure[J].Cell,1990,61(2)：213
222.DOI：10.1016/0092-8674(90)90802-L.
[15]乔笑芹，王进雅，路康，等.重组法国梧桐花粉过敏原2
(rPla a2)对诱导型一氧化氮合酶(NOS2)基因启动子活性及
基因表达的影响[J].中国免疫学杂志，2018,34(8):1143-
1147.DOI：10.3969/j.issn.1000484X.2018.08.004.
[16]成笛，曾永娣，陈开丰，等.蓝孔雀CHD1基因PCR快速性
别鉴定方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医,2020,22(22):143-
146.DOI：10.ki.hljxm sy.2020.04.0263.[17]KATJA Z,THOMAS B,RICHARD J,et al.Arapidinvitro
polyomavirus DNA replication assay[J].J V irol Methods,2004,
122(1)：123-127.DOI：10.1016/j.jviromet.2004.08.012. [18]TANG Y,VILLINGER F,STAPRANS S I,et al.Slowly declining
levels of viral RNA and DNA in DNA/recombinant modified
vaccinia virus Ankara-vaccinated macaques with controlled
simian-human immunodeficiency virus SHIV-89.6P challenges
[J].J Virol,2002,76(20)：10147-10154.DOI：10.1128/
JVI.76.20.10147-10154.2002.
[19]林艳云，陈忆婷，黄晓明，等.真菌菌体直接PCR扩增的方法
研究[J].生物化工，2018,4(6)：7-10.DOI：10.3969/
j.issn.2096-0387.2018.06.002.
[20]张肄鹏，黄志平，聂冬梅，等.1种人类血小板抗原1~17及
Cab等位基因全血直接检测方法的建立[J].国际检验医学,
2017,38(14)：1895-1897,1900.DOI：10.3969/j.issn.1673
4130.2017.14.009.
[21]仇超，彭虹，黄相刚，等.携带绿色荧光蛋白基因的单轮
感染活性HIV假病毒的建立及其活性检测[J].中华微生物
学和免疫学杂志，2006,26(5)：394-398.DOI:10.3760/j.
issn：0254-5101.2006.05.003.
[22]杨婧，耿文清，张旻，等.HIV-1基因型、假病毒表型与活
病毒表型耐药检测结果的比较[J].中华实验和临床感染病
杂志(电子版),2014,8(3)：308-313.DOI：10.3877/
cma.j.issn.1674-1358.2014.03.002.
[23]王萍，陈欢，罗荣华，等.VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒
筛选抗HIV-1药物的条件优化及应用[J].中国药理学通报,
2016,32(3)：433438.DOI：10.3969/j.issn.1001-1978.2016.
03.026.
[收稿2020-03-02修回2020-04-08]
(编辑苗磊)
(上接第324页)
[17]沈钲杰，朱银银，沈凡含，等.lncRNA与miRNA调节关系和
ceRNA关系在疾病中的研究进展[J].中国细胞生物学学报，
2018,40(10)：160-166.DOI：10.1186/s12885-019-5983-8. [18]SHRESTHA S,YANG C D,HONG H C,et al.Integrated micro-
RNA-mRNA analysis reveals miR-204inhibits cell proliferation in
gastric cancer by targeting CKS1B,CXCL1and GPRC5A[J].Int
J Mol Sci,2018,19(1)：87-103.DOI：10.3390/ijms19010087.
[19]CHEN P H,CHANG C K,SHIN C M,et al.The miR-204-3p-
targeted IGFBP2pathway is involved in xanthohumol-induced
glioma cell apoptotic death[J].Neuropharmacology,2016,110
(Pt A)：362-375.DOI：10.uropharm.2016.07.038.
[20]ZHL X,SHEN H,YIN X,et al.IL-6R/STAT3/miR-204feedback
loop contributes to cisplatin resistance of epithelial ovarian cancer
cells[J].Oncotarget,2017,8(24)：39154-39166.DOI：
10.18632/oncotarget.16610.
[21]HAN Z,ZHANG Y,SLN Y,et al.ERp-mediated alteration of cir-
cATP2B1and miR-204-3p signaling promotes invasion of clear
cell renal cell carcinoma[J].Cancer Res,2018,78(10)：2550
2563.DOI：10.1158/0008-5472.CAN-17-1575.
[22]LEE Y,YANG X,HLANG Y,et al.Network modeling identifies
molecular functions targeted by miR-204to suppress head and
neck tumor metastasis[J].PLoS Computat Biol,2010,6(4)：
e1000730-e1000745.DOI：10.1371/joumal.pcbi.1000730. [23]潘兆宝，吉华青，韩丽芳，等.miR-204在肺癌组织中的表达
与临床病理的关系[J].中国社区医师,2017,33(36):104
105.DOI：10.3969/j.issn.1007-614x.2017.36.60.
[24]SHAO Y,LIANG B,LONG F,et al.Diagnostic microRNA
biomarker discovery for non-small-cell lung cancer adenocar
cinoma by integrative bioinformatics analysis[J].Biomed Res Int,
2017,2017：2563085-25631093.DOI：10.1155/2017/2563085.
[收稿2019-10-22修回2020-01-02]
(编辑张晓舟)
