华中科技大学
硕士学位论文
N-半胱氨酸化壳聚糖的合成、表征及转基因的初步研究
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：生物医学工程
指导教师：***
2011-05-18
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摘要
本论文研究了通过巯基化修饰合成的半胱氨酸化壳聚糖与质粒DNA的结合及在谷胱甘肽(GSH)的作用下对质粒DNA的释放情况。
基因治疗已成为近二十年来生物医学研究领域的一个热点。由基因治疗而引发的热点问题是基因载体的选择和构建。基因载体一般分为两大类：病毒型基因载体和非病毒型基因载体。病毒型载体效率较高，但存在导向性差、携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性等安全性隐患。因此，非病毒性基因载体受到越来越多的关注。其中，壳聚糖因其良好的生物相容性、天使翅膀图片
阳离子性和生物可降解性而备受关注。
判断一种基因载体的优劣取决于结合pDNA的能力和进入细胞后释放pDNA的能力。然而壳聚糖作为基因载体存在两个缺点：一是壳聚糖水溶性差，二是进入溶酶体后壳聚糖释放pDNA效率较低。由于细胞内外GSH的浓度差异很大，细胞内浓度~10 mM，但细胞外浓度<10 M，GSH对于壳聚糖-pDNA纳米粒的结合及分离有一定的作用。故本实验采用化学接枝法合成了三种不同取代度的半胱氨酸化壳聚糖，并采用分子量测定，FT-IR，XRD和元素分析对其进行表征。结果显示，N-半胱氨酸激励学习的名言警句
化壳聚糖成
功合成，并且结晶性能下降，因此水溶性增强。经GSH处理和电泳分析表明半胱氨酸化壳聚糖结合质粒DNA的能力和壳聚糖类似，在GSH的作用下，半胱氨酸化壳聚糖释放质粒DNA的能力优于壳聚糖。
关键词：壳聚糖；半胱氨酸；基因载体；谷胱甘肽；质粒DNA
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Abstract
In this study, a ries of water-soluble chitosan-N-cysteine with various degrees of substitution from 4.44 to 12.03% were synthesized by reacting amino groups of chitosan with cysteine. The ability of the materials to bind plasmid DNA and to relea plasmid DNA under the action of glutathione(GSH).
In the recent 20 years, gene therapy has become a hot topic in the biomedical rearch field. Cau
d by the gene therapy is a hot issue of the choice and construction of gene vectors. Gene vector is generally divided into two categories: viral and non-viral gene vector. Viral vectors are efficient, but it has some disadvantages: low carrying capacity, immunogenicity and potential tumorigenicity curity risks. Therefore, the non-viral gene carriers have been paid more attention to. Among them, chitosan is paid clo attention becau of its good biocompatibility, cationic and biodegradation.
Judge a gene carrier quality depends on the ability of binding pDNA into cells and releasing pDNA to express. However, chitosan as a gene vector has two drawbacks: one is the poor water-soluble, the other is the low efficiency of releasing pDNA in the lysosome. The concentration of GSH of intracelluar and extracellular are widely different, the intracellular concentration of ~ 10 mM, but the extracellular concentr纳兰容若词
ation of <10 M, and GSH has certain effect for the combin消防演练总结
ation and paratio除夕之夜作文600字
n of chitosan-pDNA nanoparticles. Aries of water-sol最难的谜语
uble chitosan-N-cysteine with various degrees of substitution from 4.44 to 12.03% were synthesi养老金入市
zed by reacting amino groups of chitosan with cysteine. And the chemical structures and physical properties of chitosan-N-cysteine were characterized by Fourier-thansform infrared (FT-IR), X-ray diffraction (XRD),and elemental analysis. Results show that the crystallinity of chitosan-N-cysteine decread, so water-solubl田字成语
e enhanced. The electrophoresis analysis showed that the ability of chitosan-N-cysteine binding plasm
id DNA was similar to chitosan. Under the effect of GSH, the ability of chitosan-N-cysteine releasing plasmid DNA was better than chitosan.
The results show that chitosan-N-cysteine would be a promising non-viral vector for safe and efficient plasmid DNA delivery.
Key words: chitosan; cysteine; gene vector; glutathione; plasmid DNA
独创性声明
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本论文
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1 绪论
1.1 基因治疗
基因治疗（gene therapy）是指将正常的外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的[1]。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。目前的基因治疗技术发展迅速，已经可以治疗多种疾病，特别是遗传疾病和感染类疾病的治疗较有成效。随着动植物基因工程研究的相继开展，先后出现了化学介导，生物介导和物理介导等类型方法[2]。
基因治疗载体应具备易进入细胞、靶向性、稳定性、安全性和易制备等特点，一般分为病毒性载体和非病毒型载体[3]。虽然病毒型基因载体转染效率高，但是由于其免疫原性和潜在致癌性等安全性问题
而在临床应用上受到很大限制[4]。1999年，用腺病毒载体治疗一位年轻患者的部分鸟氨酸氨甲酞转移酶缺乏症，结果腺病毒不仅侵袭靶向的肝细胞，还引起了呼吸系统的免疫反应，最终因多器官衰竭而死[5]。2002年，一个患有严重免疫缺陷的男孩在经基因治疗后患上了非白血性白血病。这些病例的出现，使基因治疗一度进人低谷。因此，需要寻求一种更为安全的基因载体，而非病毒基因载体以其设计灵活、低毒性、低免疫原性、低致瘤性、易制备及可以实现细胞特异性和长期基因表达的优点，为基因治疗开辟出一条新的道路[7]。
理想的非病毒载体需要满足以下条件：
① 保护DNA不被细胞外DNA降解酶的降解；
② 携带DNA穿透细胞膜；
③ 保护DNA在进人核前不被细胞内容酶体和酶等降解；
④ 能有效将有活性的基因插入目的区；
⑤ 可生物降解，从细胞中消除；
⑥ 无细胞毒性[8]。
