敲除鼠的构建

如何设计条件性基因敲除小鼠模型

摘要：

小鼠和大鼠可谓是生羚羊角片 命科学实验室里的明星，成功的茶图片唯美图片 小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学

的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家

参考。

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的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家

参考。

条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性

重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放

置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre

的小鼠交配繁殖，以获得在特现代诗冰心 定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时

实现时空两方面的调控。

Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成

分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个

8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中间这8个秋天树叶 碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识

别的位点。 令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成

的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。

如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得

到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。 跟Flox小鼠交配之后，可

以得到条件性基因敲除小鼠。

所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。这段序列就是

Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚

胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟Cre工具小鼠交配，

由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于

不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性

敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏

等。

那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条

件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一般情况下，不

要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP

序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。

这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF

内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功

能。在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧)，该外显子的碱基

数目不能是3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个

与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白。如果一个外显子的碱基数目是3N+1或3N+2，

敲除这个外显子之后会产生移码突变，就可以达到基因敲除的目的。筛选要敲除(Floxed)的

外显子的时候，一般是从最上游的外显子开始筛选适黄童 合敲除的外显子。需要注意的是，一般

的DNA分析软件不能确定内含子和外显子的边界，需要仔细核对。95%以上的边界遵循

gt/ag边界原则。也可以在Enmbl上查一个基因的外显子和内含子。这个网站上的结果绝

大部分是正确的。但也需要仔细核对。毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过程，需

要特别小心。前期做多少的考虑都不嫌多。这些原则只是对一般课题的考虑。特殊情况需要

特殊处理。比如，如果只是想敲除一个基因的某个特定domain，或是如果一个基因有一个

很大的外显子，这个时候即使这个外显子的碱基数目是3N，也可以对其进行敲除。