荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础

上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组

成部件有三个(图1．1)：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分

析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通

过配位键，氢键等作用实现。2．信号报告基团(发色团, F)，把识别

基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出

信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生

的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光

等)。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，

根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚

甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号

的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿

命的变化等。

图1.1 荧光探针的结构

1.1.1 荧光探针的一般设计原理

(1) 结合型荧光探针

[21]

1 / 12

+

Signalling

Space

subunit

Binding

subunit

Analyte

Output

signal

图1.2 共价连接型荧光探针

结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接

起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过

对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命

的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，

必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、

合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光国大药房是国企吗 基团要有强

的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes 位

移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现

象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，广东靓汤 可避免

复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区

发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的

使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以

软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力

等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分

2 / 12

子。(c) 荧光超分子受体的组装：组装荧光超分子受体就是利用一个

连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起，要充分考虑

到识别基团和荧光基团之间能通过连接基进行信号传递，对识别对

象的识别信息（如荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变

化等）可以及时传递出去。

N

N

N

1

图1.3 共价连接型锌离子荧光探针

De Silva 在1997年报道的化合物1 是一个典型的共价连接法

[22]

设计的荧光探针。它分别以有优良光学性质的蒽作为荧光基团，以

对Zn有特异性识别的基团双( 2-吡啶甲基)氨 (DPA)为识别基团，

2+

通过亚甲基将识别基团和荧光报告基团连接在一起。通过对比加锌

前后荧光强度的不同实现了对锌离子的检测。

(2) 置换型荧光探针

3 / 12

图1.4 置换型荧光探针

利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂

和被分析物结合能力的强弱来实现对被分析物的检测。该类传感器

对识别基团和荧光指示剂的要求都比较高，既要选择能和识别基团

结合但结合能力又不是特别强的荧光指示剂，又要设计对被分析物

能特异识别的识别基团。该类设计方法多用于阴离子传感器的设

计。

2002 年，Kim小组设计了邻苯二酚紫作为荧光指示剂，双锌

[23]

配合物为HPO 识别基团，并将二者自组装成化合物2，用于中性

4

2-

条件下水溶液中HPO的检测。加入识别客体 HPO 后，由于

44

2-2-

HPO 与双锌配位能力强于邻苯二酚紫，从而把邻苯二酚紫挤开，

4

2-

使之进入溶液，表现为其原来颜色。在识别过程中，溶液颜色从蓝

色变为黄色，常见的 Ac、CO、NO、N、ClO、S、F、Cl

-2----2---

3334

、Br都不影响 HPO 的检测，表现出较好的选择性。

-2-

4

4 / 12

图1.5 置换型HPO化学传感器

4

2-

(3) 化学计量型荧光探针（chemodosimeter）

化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特异

不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行检测

的一类探针。主要包括两种类型：一类是目标离子和探针分子发

[24]

生化学反应后仍旧通过共价键相连接:另一类是目标离子催化了一个

化学反应（图1.6）。

图1.6 化学计量法的两种类型

一般而言，化学计量型荧光探针分子都具有专一性和不可逆

性。尽管这类探针已有不少报道,但由于设计较为困难和反应不够灵

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敏等缺陷而进展较为缓慢。

3

4

图1.7 氨基酸荧光分子探针

Kim和Hong等设计的识别半胱氨酸及高半胱氨酸的荧光分子

[25]

探针3， 属于第一种类型。他们利用半胱氨酸及高半胱氨酸与醛生

成五元噻唑环或六元噻嗪环的特异反应以及反应前后化合物3和4

荧光性质的显著差异实现了对半胱氨酸及高半胱氨酸的高选择性检

测。

化合物 5是较早应用化学反应原理实现检测客体的荧光探

[26]

针，属于第二种类型。化合物5的乙腈溶液中加入汞离子后荧光显

著增强(34倍)并红移，进一步用质谱检测发现生成了脱硫产物6。

5

6

图1.8 基于汞脱硫原理的汞离子荧光探针

6 / 12

1.1.2 荧光分子探针的响应机理

目前，荧光分子探针的响应机理主要有以下几种：光致电子转

移（PET, photo-induced electron transfer）、分子内电荷转移（ICT,

intramolecular charge transfer）、荧光共振能量转移（FRET,

fluorescence resonance energy transfer）等。

(1) 光诱导电子转移原理（PET）

光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的

电子给体与电子受体之间发生电子转移的过程。典型的光致电子转

移荧光探针体系是由具有电子给予能力的识别基团R通过连接基团

S和荧光基团相连组成的功能分子。

一般情况下，荧光分子探针的识别基团是电子给体，荧光基团

是电子受体，并且通常情况下多采用含有氨基的基团作为识别基

团。具体PET工作过程如下：在识别基团与待测物种结合之前，当

荧光基团受激发，具有给电子能力的识别基团能够使其处于最高占

据轨道的电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使

被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，导致荧光基

团的荧光猝灭。而识别基团与待测物种结合之后，由于降低了识别

基团的给电子能力，光致电子转移过程被减弱或者不再发生，荧光

基团的荧光发射得到恢复（如图1.9）。

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PET

PET

荧光基团

(Fluorophore)

h



exc

h



fluo

(linker)

连接体

识别基团

荧光基团

(Recepter)

(Fluorophore)

h



exc

h



fluo

(linker)

连接体

识别基团

(Recepter)

(a)

(b)

图1.9 荧光分子光致电子转移的“开”“光”过程示意图。

由于与待测物种结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的

“关”、“开”状态，因此这类荧光分子探针又被称为荧光分子开关。

PET荧光分子探针的作用机制可由前线轨道理论来进一步说明

[2]

（见图1.10）。从图可以看出，识别基团处于自由态时，其HOMO

轨道上的电子可以向荧光基团的HOMO轨逐梦新时代 道上转移，致使荧光基团

被激发到LUMO上的激发态电子不能返回基态而难以产生荧光，此

过程对应于发生PET现象。在识别基团与待测物种结合后，识别基

团上的HOMO电子已无法转移到荧光基团的HOMO轨道上，使

PET过程无法进行，这时荧光基团的激发态电子可以返回基态，产

生荧光。由此可见，利用识别基团对PET过程的控制可以实现对体

系荧光发射状态的调控。

荧光团荧光团

结合受体前结合受体后

图1.10 光致电子转移机制机制的前线轨道理论解释。

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化合物1是一个非常典型的PET机理荧光增强型的例子。锌离

子不存在时，由于识别基团中氮原子上的孤对电子能够在荧光基团

受激发态时占据激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被

光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，导致荧光基团

的荧光猝灭，即发生了光致电子转移（PET）。当Zn存在时，Zn

2+2+

离子与两个吡啶氮及氨基配位，束缚了氮上的孤对电子，使发生在

氮原子和荧光团之间的 PET 过程被禁阻，荧光强度大幅度增强．实

验结果也证实了此过程。在乙腈溶液中，加入Zn 离子之前，化合

2+

物1的荧光量子产率仅为 0.01；加入Zn离子之后，它的荧光量子

2+

产率为0.77，荧光增强了77 倍。

(2) 分子内电荷转移( ICT )机理

分子内电荷转移荧光探针分子通常由富电子基团（电子给体）

和缺电子基团（电子受体）共轭相连，形成推-拉作用的共轭体系，

没有 PET 探针分子那样明显的连接基。也就是说荧光团F和受体R

通常融合在一起，识别过程二者同时参与。当受体结合被分析物

后，作为受体的供电子部分或拉电子部分的供拉电子能力被改变，

整个共轭体系的电荷重新分麦芽粥 布，荧光团的推-拉作用被抑制或强

化，进而导致吸收光谱、激发光谱以致发射光谱发生红移或蓝移

（如图1.11）。

[27]

化合物7 两端分别含有羰基、苯并噻唑两个强拉电子基和两

[28]

个氨基强供电子基团，激态时荧光团能够有效地实现了从供体到受

9 / 12

体的整个体系电荷分离，是典型的ICT机理的荧光分子探针。当

汞离子存在时，四氨基识别基团捕获Hg离子, 6, 7 位氮的供电子能

2+

力大大减弱，减弱了整个体系电荷分离程度，引起吸收波谱和荧

光光谱分别蓝移了60 nm 和92 nm ，荧光颜色由蓝色变为黄色，同

时实现了比色及比率型Hg离子的检测。 什么的雄鹰

2甲午战争史 +

图1.11 识别基团分别为电子供体和电子受体的ICT过程光谱移

动示意图

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7

8

打羽毛球英语

图1.12 具有D-A结构的ICT汞离子荧光探针

(3) 荧光共振能量转移(FRET)机理

荧光共振能量转移是指当一对合适的能量给体分子(Donor)和受

体分子(Acceptor)相距一定距离(一般为2-5 nm)，且给体的发射光谱

与受体的吸收光谱能有效重叠时，处于激发态的给体将把一部分或

全部能量转移给受体，使接受体被激发的过程。受体可以是荧光物

质也可以是只有吸收而没有发射的荧光猝灭剂。根据Frster理论，

共振能量转移效率可以用式 1.5 表示:

[29]



T



1



R

1





R

0

6

(1.5)

式中R为两个荧光基团的距离，R为Frster距离(供体-受体之间的

0

临界转移距离)。从这个方程可以看出，即使R的微小变化都会导致

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9

10

能量转移的效率强烈改变。

[24-26]

图1.13具有D-A结构的FRET汞离子分子荧光探针

利用FRET效率对升旗仪式时间 距离的强的依赖性，FRET广泛应用于蛋白质

和核酸的结构及动力学研究、分子结合的测定等领域。同样，能

[30]

量共振转移原理也被用于荧光分子探针的设计。

2004年，Ono小组设计了以荧光素为能量供体，以没有发射

[31]

的荧光猝灭剂4-(4- 二甲氨苯偶氮)苯甲酰基为受体，二者通过富含

胸腺嘧啶的碱基连接在一起。当加入汞离子之前，供体受体之间的

距离较长，二者不会发生能量共振转移，只发射荧光素的荧光；当

加入识别客体Hg后，含有多个T的碱基发生特异性分子识别，拉

2+

近了荧光素和4-(4-二甲氨苯偶氮)苯甲酰基间的距离，发生荧光素向

4-(4- 二甲氨苯偶氮)苯甲酰基的能量转移，从而猝灭荧光素的荧光。

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