产品使用说明书
BCA蛋白定量试剂盒
试剂盒简介
以下货号试剂盒可参照此说明书操作:建议同时参考本说明书英文原文(说明书编号TB380)。
BCA Protein Assay Kit:500 / 2500 rxn 货号71285-3
BCA蛋白定量方法是基于双缩脲反应,即在碱性溶液中蛋白将Cu还原成Cu,而根据检测到的单价Cu离
子的浓度可以检测体系中对应蛋白的量。Bicinchoninic acid是一种显色剂,可以螯合被还原的铜离子,产生
一种在562nm有强吸收的紫色复合物。Novagen的BCA试剂盒可以用于测定浓度在20-2,000g/ml范围内的
蛋白的浓度,根据样品量分为标准型和微型两种形式进行测定。试剂盒提供的组分足够用于500次标准型反
应(50l蛋白样品加上1ml反应试剂)或2,500次微型测定(25l蛋白样品加上200l反应试剂,可以在96孔
板中进行高通量定量)。试剂盒中提供的BSA(牛血清白蛋白,2mg/ml)为用户制作标准浓度曲线提供了便
利。Novagen的BCA试剂盒准确度高,兼容性好,能与各种经典绕口令大全 化学试剂和表面活性剂兼容,亲尝汤药 可以方便地配合默
克Novagen的BugBuster,PopCulture,CytoBuster™,Reportasol™和Inct PopCulture抽提蛋白的细胞
裂解试剂一起使用。有些化学成分,例如螯合剂,强酸、强碱、还原剂等,可能会干扰BCA法采用的还原及
螯合定量过程,详细情况请看说明书后附列表。
试剂盒提供的组分
500ml BCA反应液(0.1M NaOH缓冲的bicinchoninic acid,碳酸钠,酒石酸钠,碳酸氢钠,pH11.25)
15ml 4% 硫酸铜
31ml BSA标准品(2mg/ml)
2+ 1+
储存
室温存放。
相关配套产品
可以与默克Novagen各种蛋白抽提、纯化试剂盒配套使用。
BCA蛋白定量分析
制备BSA浓度标准曲线
下表是制备各稀释梯度的BSA标准液的方法。每个标准液都需要使用一个新的试管。为了尽量保证定量的准
确性,建议采用与蛋白样品一样的缓冲液来稀释、配制BSA标准液。如果缓冲液中有干扰BCA法的成分,建
议用去离子水替代样品的缓冲液,用以配制BSA浓度梯度标准液做标准曲线。
制备浓度梯度BSA标准液
试管编号 BSA的体积 稀释液的体积 BSA的终浓度
1 250ul 1000ug/ml
从2mg/ml溶液中取250ul
2 250ul500ug/ml
从管1中取250ul
3 250ul250ug/ml
从管2中取250ul
4 300ul125ug/ml
从管3中取300ul
5 400ul25ug/ml
从管4中取100ul
6 400ul0ug/ml
0
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bioteam@
加强型检测的BSA浓度梯度标准液的制备
试管编号 BSA的体积 稀释液的体积 BSA的终浓度
1 700ul 250ug/ml
从2mg/ml溶液中取100ul
2 400ul125ug/ml
从管1中取400ul
3 450ul50ug/ml
从管2中取300ul
4 200ul25ug/ml
从管3中取200ul
5 400ul5ug/ml
从管4中取100ul
6 400ul0ug/ml
0
BCA蛋白定量的工作液的制备
下表给出了BCA工作液的制备建议。工作液是以50份的BCA反应液与1份4%硫酸铜混合而成。
注意:标准型测定的工作液的体积是每反应;这对于小吸光杯()足够了,如果采用较大的
BCA1ml0.7ml
吸光杯,则需要以上的工作液。
3mlBCA
BCA工作液的制备
每个样品 20
标准型定量
1ml20ml
BCA溶液
20ul400ul
4%硫酸铜
微型定量
4ml200ul
BCA溶液
4ul80ul
4%硫酸铜
定量的操作流程
以下提供了2种定量操作:标准型定量需要的蛋白样品较多(50ul),这种情况下BCA工作液与蛋白样品的
体积比是20:1,干扰定量的物质的影响会较小;微型定量需要的蛋白样品量较少(25ul),非常适合96孔板
式的高通量操作。此种情况下BCA工作液与蛋白样品的体积比是8:1,干扰定量的物质的影响相对会较大。
标准定量操作
1. 吸取50ul标样或样品到标记好的试管中。
2. 加入1ml BCA工作液。轻柔涡旋混描写景物 匀。
注意:如果吸光杯测量时要求的溶液体积较大,反应体系体积可能需要增加到(即工作液加
3.15ml3ml BCA
150l
标样或样品)。
3. 标准检测:加强型检测::在37C孵育30min或室温放置2–16h。加强型检测:在60C孵育15min。
标准检测加强型检测
4. 将试管冷却至室温。
注意:虽然在冷却至室温的过程中显示反应仍在继续,如果内进行读数蛋白浓度也不会产生误差。
10min
5. 在一个干净的吸光杯中加入杏仁的功效与作用禁忌 1ml水,在波长562nm调零。
6. 将待测液加入干净的吸光杯。
7. 10min内测定并记茶疗 录所有反应液的吸光值(A)。
562
8. 校正的吸光值是将各标样和试样的读数减去空白样吸光值。
9. 结合已知的BSA标样的量和校正过的吸光值画出标准曲线。
10. 参照标准曲线,根据各蛋白试样的校正吸光值,在标准曲线的线性范围内读出各样品的蛋白浓度。
11. 根据样品体积和稀释度计算原来样品中的蛋白量。
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微型定量操作
微型定量操作
1. 吸取25ul标样或样品分别加入到96孔板的各孔中。
2. 每孔加入200ul的BCA工作液。摇晃混匀30s,盖住各样品孔。
3. 标准检测:加强型检测::在37C孵育30min或室温放置2–16h。加强型检测:在60C孵育人生感悟说说 15min。
标准检测加强型检测
4. 冷却至室温。
5. 在562nm吸光值。
注意:如果光度计没有配备滤波片,波长在范围的都可以使用。
562nm540–590nm
6. 校正的吸光值是将各标样和试样的读数减去空白样吸光值。
7. 比照已知BSA量制作的标准曲线读取蛋白浓度。
注意:如果机器附带提供标准曲线软件可以帮助获得最精确的结果。
8. 参照标准曲线,根据各蛋白试样的校正吸光值,在标准曲线的线性范围内读出各样品的蛋白浓度。
9.
根据样品体积和稀释度计算原来样品中的蛋白量。
常见问题及改善建议
现象 可能的原因 改善建议
所有反应中白血病病因 都没有颜色产生 样品中含有铜螯合剂 增加BCA工作液的铜离子浓度(例如可用
缓冲液中含有硫醇 可对样品做透析或稀释处理
缓冲液中含有还原剂 可对样品做透析或稀释处理
缓冲液中含有生物胺(例
如儿茶酚胺类物质)
波长设定不对
样品处于较强的酸性或碱
性缓冲液中
样品中含有脂类或脂蛋白
蛋白浓度过高 稀释样品
所有反应(包括空白对照)
都呈现深紫色
可对样品做透析、除盐或稀释处理
BCA溶液与4% CuSO按50 : 2配制)
4
可对样品做透析或稀释处理
在562nm测吸光值;可以在540-590nm范
围测,但是灵敏度会降低
可对样品做透析、除盐或稀释处理
样品中加入终浓度为2%的SDS以减少脂
质的影响 吸光值高于预期
空白对照正常,但标准样和
试样吸光值都远远低于预期
试剂兼容性
不兼容试剂或物质
以下试剂或物质浓度很低时也会干扰BCA法进行定量,应该在样品中尽量避免出现。如果不能避免这些干
扰成分,应选用Non-Interfering Protein Assay™ Kit (货号488250)以准确定量。
这个表并不全面,还有
一些试剂和物质可能干扰定量未被列出。
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可兼容试剂
下表中列出了与BCA蛋白定量方法兼容的试剂或物质种类及其不干扰定
量的最大浓度数值。这个表并不全面,还有一些试剂和物质会或不会干
扰定量未被列出。
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