2023年4月19日发(作者：宣城中学)高山被孢霉GDP-L-岩藻糖合成途径中GDP-甘露糖-4,6-脱
水酶的克隆、表达和功能鉴定
王鸿超;张陈;周昕;陈海琴;顾震南;张灏;陈卫;陈永泉
【摘 要】GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩
藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能.高山被孢霉是重要的
产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌.GDP-L-岩藻糖从
头合成途径中的GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)能催化GDP-D-甘露糖合成GDP-
4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖.对高山被孢霉中的GMD基因进行克隆、表达和功能鉴
定,可进一步阐明GDP-L-岩藻糖体内代谢的分子生物机制.首先对GMD序列进行
分析,并以pET28a+质粒为骨架构建了GMD的表达载体,然后转化至大肠杆菌
BL21中进行诱导表达.进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用液相色谱-
质谱法分析酶反应产物,表明纯化蛋白具有GMD活性.最后对高山被孢霉进行发酵
培养,发现GDP-L-岩藻糖产量在氮源耗尽后较高,可达0.10 mg/g.同时GMD的转
录水平在氮源耗尽后发生了明显的上调,表明GMD在氮源耗尽后对高山被孢霉体
内GDP-L-岩藻糖的合成具有重要作用.这为进一步利用高山被孢霉发酵生产GDP-
L-岩藻糖和酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2016(042)011
【总页数】6页(P14-19)
【关键词】功能鉴定;从头合成途径;GDP-甘露糖4,6-脱水酶;GDP-L-岩藻糖;高山
被孢霉
【作 者】王鸿超;张陈;周昕;陈海琴;顾震南;张灏;陈卫;陈永泉
【作者单位】江南大学食品学院,江苏无锡,214122;江南大学食品学院,江苏无
锡,214122;江南大学食品学院,江苏无锡,214122;江南大学食品学院,江苏无
锡,214122;江南大学食品学院,江苏无锡,214122;江南大学食品学院,江苏无
锡,214122;江南大学食品学院,江苏无锡,214122;江南大学食品学院,江苏无
锡,214122
【正文语种】中 文
核糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物[1]。GDP-L-岩藻糖是L-岩藻
糖的活性核糖形式，参与多种生物反应，包括寡糖、糖蛋白和糖脂的合成[2]。岩
藻糖基化需要GDP-L-岩藻糖作为岩藻糖转移酶的供体，其产物岩藻糖化复合物可
参与多种生物和病理过程，包括组织发育、受精、细胞粘附、肿瘤转移、炎症反应
和血管生成[2]。GDP-L-岩藻糖是一种相对稀有的核糖，价格昂贵，化学合成较为
复杂，科学家一直在探寻GDP-L-岩藻糖的更多来源。
微生物可作为GDP-L-岩藻糖的另一来源，但利用微生物发酵生产GDP-L-岩藻糖
受多种因素的影响。目前，GDP-L-岩藻糖的生物合成途径主影视公司名字
要有两大类：从头合
成途径和补救合成途径[3](图 1)。GDP-L-岩藻糖的从头合成途自强不息
径中，GDP-甘露糖
-4,6-脱水酶(GMD)可将GDP-D-甘露糖转化为GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，
进一步由GDP-酮-6-脱氧甘露糖 3,5-表异构酶/4-还原酶(GMER)转化为GDP-L-
岩藻糖。来源在不同生物体中的GMD已经完成了分子水平的鉴定，包括人[4]、
幽门螺杆菌[5]、大肠杆菌[6]、秀丽隐杆线虫及果蝇[7]、草履虫小球藻病毒[8]和
拟南芥[9]等。
高山被孢霉是公认的可合成多不饱和脂肪酸的产油真菌，是工业上产多不饱和脂肪
酸最重要的微生物之一[10-11]。大部分真菌不能够合成GDP-L-岩藻糖，然而，
高山被孢霉是唯一在分子水平上证明具有GDP-L-岩藻糖合成途径的真菌[12]。对
高山被孢霉基因组测序结果分析表明[13]，其基因组中存在编码GMD的3个基因。
由于GDP-L-岩藻糖从头合成途径占细胞中GDP-L-岩藻糖总产量的90%[2]，对
GMD进行克隆表达，进而研究其催化活性，对于研究高山被孢霉GDP-L-岩藻糖
生物合成机理具有重要意义。
为了阐明真菌中GDP-L-岩藻糖生物合成的分子生物学机制，本文选择了高山被孢
霉中的一个GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)基因进行克隆、表达和功能鉴定。并
对高山被孢霉进行发酵培养，对其氮源耗尽前后不同时间点的GDP-L-岩藻糖含量
进行分析，并利用实时荧光定量PCR对GMD的转录水平进行研究，确定GMD
在GDP-L-岩藻糖中的转录调控规律。本研究为进一步利用高山被孢霉发酵生产
GDP-L-岩藻糖和酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础。
1.1 材料与试剂
高山被孢霉(Mortierella alpina ATCC 32222, M. alpina)购于美国标准生物品收
藏中心，由本实验室菌种库保藏，并已对其完成基因组测序。pET-28a(+)、E.
coli Top10和E. coli BL21本实验室保存。
Trizol (Invitrogen)；限制性内切酶，Prime Script RT reagent kit(TaKaRa)；T4
DNA liga、TEMED、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、DNA maker(Promega，美
国)；KOD 酶(TOYOBO)；卡那霉素、IPTG、溶菌酶、RNa A、DNA酶、质粒
抽提试剂盒、 PCR 产物纯化试剂盒、胶回收试剂(上海生工)。
1.2 仪器与设备
液相色谱质谱联用检测仪(LC-MS),热电(美国)；TSK gel Amide-80色谱柱(150
mm 2.0 mm, 2.0 m),TOSOH(日本)；HisTrap纯化柱,GE Healthcare；冷冻
离心机,热电(德国)；荧光定量PCR仪,伯乐(美国)；凝胶成像分析系统,伯乐(美国)；
微量紫外分光光度计,热电(美国)；PCR仪,伯乐(美国)。
1.3 实验方法
1.3.1 高山被孢霉的培养
参考之前的培养方法对高山被孢霉进行发酵培养，并对培养基残氮含量进行测定
[14]。
1.3.2简爱推荐语
基因搜索
对于已完成的高山被孢霉(ATCC 32222)基因组(基因库序列号ADAG01000000)，
使用BLAST程序在NR ()，KOGs和COGs，KEGG，
Swiss-Prot，UniRef100，和BRENDA蛋白数据库中进行比对，E值设为1E-5，
注释目的蛋白。
1.3.3 GDP-L-岩藻糖含量分析
高山被孢霉GDP-L-岩藻糖提取和分析方法参考文献[15]。
1.3.4 表达载体的构建
利用Trizol试剂(Invitrogen)根据说明书提取总RNA。RNA经过无RNA酶的
DNA酶消化，然后利用RNea Mini kit (Qiagen)纯化。总RNA用
PrimeScript RT reagent kit (Takara)根据说明书进行反转录，得到cDNA。采用
表1中的GMD引物，在上游引物引入Nhe I位点，下游引物引入EcoR I位点，
对GMD基因进行扩增。PCR条件：变性94 ℃，30 s；退火55 ℃，45 s；延伸
68 ℃，1 min(总共25个循环)；将纯化后的PCR产物通过酶切连接到到
pET28a+上，电转进E. coli Top10。对转化子进行酶切和 PCR 鉴定后，筛选出
阳性转化子送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，构建表达质粒。所用PCR
验证引物及测序引物均为T7和T7ter，如表1所示。
1.3.5 蛋白表达和纯化
将携带GMD基因的重组质粒导入E. coli BL21，接种于20 mL选择性LB培养基
中(含有50 g/mL 卡那霉素)，37 ℃，200 r/min过夜培养。1%接种量接种于
250 mL含有卡那霉素的LB培养基，37 ℃，200 r/min培养至OD600值为0.6
左右。加入IPTG进行诱导，离心收集菌体，用结合缓冲液(50 mmol/L Tris/HCl,
300 mmol/L NaCl和10 mmol/L 咪唑; pH 8.0)冲洗菌体后，再用此缓冲液重悬
菌体(加入1 mmol/L PMSF和1 mg/mL溶菌酶)，冰浴30 min后超声破碎。离
心后取上清，根据说明书使用HisTrap HP纯化柱(GE Healthcare)对带有His标
签的重组蛋白进行Ni离子金属螯合亲和层析法纯化。以50倍柱体积的洗涤缓冲
液(50 mmol/L Tris-Cl，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗涤未
结合蛋白。重组蛋白用5 mL洗脱缓冲液 (50 mmol/L Tris/HCl, 300 mmol/L
NaCl和250 mmol/L 咪唑; pH 8.0)进行洗脱。蛋白浓度采用Bradford法测定。
1.3.6 酶活测定
2.1 基因序列分析
根据基因注释的结果，得到GMD基因的序列。为了分析 GMD基因序
列与其功能的关系，将其与来自其他物种的GMD氨基酸序列进行比对(图2)。
GMD中一些保守的氨基酸序列与酶的催化特性相关，如氨基酸残基
(Gly30, Ala31, Asn126, His127, Glu78, Phe139 和Ser33)与核糖的结合相关；
氨基酸残基(Arg51, Ser53, Asn54, Asn56，Thr76, Tyr100和Lys104)与辅酶因
子的结合和催化特性相关；氨基酸残基(Val140, Lys143, Asn168, Leu161和
Val202)与GDP-岩藻糖结合相关[16]。进化分析表明， GMD与其他来
自真菌的GMD位于进化树中独立的一支，明显与植物和细菌中的GMD区分开来，
这表明 GMD很可能与动物中的GMD由同一祖先进化而来(图3)。
2.2 GMD的克隆
根据GMD基因序列设计引物，如表1所示。将提取到的M. alpina m RNA反转
录为cDNA，以其为模板进行PCR扩增，所得DNA条带大小为882 bp(图4A)。
将其连接至pET-28a(+)载体，命名为pw2994。对转化子进行PCR鉴定，其中
大小为900 bp左右的DNA条带对应的转化子为阳性转化子(图4A)。对阳性转化
子进行测序后，其测序结果与GMD的基因序列相符。
2.3 GMD的诱导表达和纯化
通过不同浓度的IPTG对pw2994进行诱导表达，并对培养温度和时间进行优化。
结果表明，高温培养和高浓度IPTG诱导不利于可溶蛋白的表达，此时表达的蛋白
多为不可溶蛋白。GMD的最适表达条件为：0.1 mmol/L IPTG，20 ℃培养16 h。
GMD的纯化条件为：上样流速0.8 mL/min，20 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液以1
mL/min的流速洗涤45 min，10 mL 20～250 mmol/L咪唑浓度的缓冲液以1
mL/min的流速进行梯度洗脱，0.5 mL分步收集。通过SDS-PAGE对纯化蛋白进
行检测，条带较为单一，无明显杂带，GMD大小为31 kDa (图4B)。最后利用
10 kDa超滤离心柱对所得蛋白进行脱盐处理，蛋白终浓度为1.21 g/mL。将纯
化后的蛋白溶于50%甘油后存于-80 ℃以备后续试验。
2.4 重组蛋白的活性分析
以GDP-D-甘露糖作为底物，与重组GMD一起进行孵育，催化产物经LC-MS分
析后，如图5所示。
当对不含有GMD的空白反应体系进行选择离子扫描时(586.06 m/z, GDP-4-酮基
-6-脱氧-D-甘露糖)，并没有检测到催化产物(图5A)。当对含有GMD的催化体系
进行选择离子扫描时(586.06 m/z, GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖)，在7.8 min
有峰出现，表明重组蛋白具有GMD活性(图5B)。为进一步确定此催化产物为
GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，对其进行了二级质谱分析。如图5E所示，二级
质谱谱图与已经报道的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖二级质谱图一致[17]，进一
步确定该重组蛋白具有GMD活性。
2.5 GMD在GDP-L-岩藻糖发酵过程中的转录调控规律
2.5.1 高山被孢霉中GDP-L-岩藻糖含量分析
氮源对于产油真菌而言，是脂质积累的决定性因素，只有在氮源耗尽的情况下，产
油真菌才开始大量积累脂质[14]。由图5D可以看出，当对M. alpina体内GDP-
L-岩藻糖进行分析时，其保留时间为7.3 min，与GDP-L-岩藻糖标样保留时间一
致(图5C)，表明从M. alpina体内成功提取到了GDP-L-岩藻糖。由峰面积对
GDP-L-岩藻糖含量进行定量，结果如图6A所示。可以看出，在氮源耗尽情况下
(22 h)，GDP-L-岩藻糖仍在持续积累，最后产量可达0.10 mg/g干重(70 h)。与
其他微生物发酵法相比[18]，M. alpina体内GDP-L-岩藻糖产量相对较高，在后
续的试验中，可进一步优化发酵条件，利用M. alpina高产GDP-L-岩藻糖。
2.5.2 GMD的转录调控规律
由图6B可以看出，在氮源耗尽后(22 h后)，GMD的转录水平都明显高于氮源耗
尽前，且在氮源耗尽前后，GMD转录水平发生了明显的上调。由于在氮源耗尽后，
GDP-L-岩藻糖仍然在持续积累，这表明GMD在氮源耗尽后的GDP-L-岩藻糖合
成过程中发挥重要作用，很可能是GDP-L-岩藻糖合成的关键因素。
综上所述，为了阐明GDP-L-岩藻糖从头合成途径的分子生物学机制，本文完成了
对M. alpina中GMD的克隆、表达和功能鉴定。构建了GMD的表达载体，并对
GMD进行了诱导纯化，纯化后的目的蛋白具有GMD活性。高山被孢霉在氮源耗
尽后GDP-L-岩藻糖持续积累，产量可达0.10 mg/g。同时GMD的表达水平在氮
源耗尽后发生了明显的上调，表明GMD氮源耗尽后对高山被孢霉体内GDP-L-岩
藻糖的合成具有重要作用。本研究为进一步利用高山被孢霉高产GDP-L-岩藻糖和
酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础。
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【相关文献】
1.3.7 液相色谱-质谱 (LC-MS) 分析
采用TSK gel Amide-80色谱柱，柱温设为35℃，流动相A为5 mmol/L醋酸铵，流动相B为乙
腈，进样量为5 L。质谱分析条件为负离子电离模式，鞘气和辅助气为氮气，探针加热温度
250 ℃，毛细管温度325 ℃，选择离子扫描设为588.08和586.06 m/z。二级质谱参数设置为：
分辨率35 000； AGC Target5105，时间200 ms；碰撞能35；变幅50%。
1.3.8 荧光定量PCR
反应体系为20 L，其中含Power SYBR Green PCR Master Mix 10 L，引物各1 L，cDNA
2 L，纯水7 L。PCR程序为95C，10 s，60 ℃，10 s进行40个循环。18S rDNA作为管家基
因。利用2-(Ct)计算基因转录水平倍数变化，其中Ct为Ct (样品)-Ct (参照)。引物序列
见表1。
