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浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备
2008年第2期
6月出版
食品工程
F00DENGINEERINC
浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备
Onthepreparationofchromosomeofperipheralbloodlymphocyteofhumanbody
董烁谢振兴
(河南大学医学院,开封475004)
DONGShuo'XIEZhen—xing
(MedicalSchool,HenanUn春节的来历和传说
iversity,Kaifeng475004,China)
摘要染色体制备技术是医学遗传学中最常见
而重要的一种技术,由于各个实验室实验条件和
个人操作手法的差异,细胞培养和染色体标本的
制作方法也不尽相同.笔者就人体外周血淋巴细
胞染色体的制片过程中容易出现的问题及近几年
制作染色体标本总结的经验和实验方法改进进行
探讨,并提出了有效的避免方法.
关键词染色体;染色体制备技术;外周血;细胞培
养
AbstractThepreparationofchromosomeisafrequent
ing
oftheexperiments,experiencesandprecautionsduring
thepreparationofchromosomeofperipheralbloodlym—
phocyteofhumanbodytheyearswerethoroughlydis-
fectivemethodshavebeengiveninthis
paper?
keywordschromoso描写春天的成语
me;preparationofchromo—
some;peripheralblood;cellculture
染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载
体,他由DNA和蛋白质构成,具有储存和传递遗传
信息的作用.人类细胞遗传学研究的主要对象是染
色体.生后置定语英语
物体细胞染色体数目和结构是重要的遗传
标志之一,特别是在真核细胞中.因此深入认识染
色体的结构和功能,对生物的遗传,变异和进化以
及细胞的增殖,个体的发生和生殖过程的平衡控制
都具有十分重要的意义.每个物种的细胞都具有一
定的数目,形态,大小的染色体特征,称为染色体
董烁,女,1976年出生,1999年毕业于河南师范大学,生物教
育专业,助教.
收稿日期:2008—03—19
组型,各种染色体技术已广泛应用于核型,鉴别变
异,体细胞杂交分析和绘制基因图等方面,因此在
染色体的分析研究中,制备染色体标本无疑是细胞
遗传学最基本而重要的技术,而优良的染色体制片
是其他技术的先决条件.
正常情况下,人外周血中是没有分裂相细胞的,
只有在异常隋况下才能发现.外周血淋巴细胞一般隋
况下处于增殖期中的GO(GD期,未经培养的外周
血中很难找到正在分裂的淋巴细胞.植物血细胞凝集
素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在
PHA作用下,能使处于GO期的淋巴细胞转化为淋巴
母细胞,进而进行有丝分裂.利用PHA这一特性,
淋巴细胞经过含有PHA培养液培养,在体外便可获
得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,再用秋
水仙素处理,即可获得终止于分裂中期的淋巴细胞,
进而得到所需的人体染色体图片.加之,淋巴细胞遍
及全身,并在所有器官组织中不断循环,能反映个体
整体水平情况而不象体细胞那样具有局部性.
1细胞培养
1.1无污染环境
培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条
件,也是实验成功与否的先决条件.收获细胞前的
所有步骤都要保持高度的无菌,严防细菌和病毒的
污染.当细胞放置于体外培养时,与体内相比细胞
丢失了对生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或
自身代谢物质积累等,可导致细胞死亡.
1.2恒定的温度
维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温
度.人体细胞培养的标准温度为36.50.5oC,偏离
这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至
食品工程2008年第2期
6月出版
死亡.如果温度高于37℃,细胞的生长速度减慢;
如果温度高于40℃,细胞受损,超过43℃,则导
致细胞死亡.培养箱的温度应严格控制在37土0.5℃,
为了能精确有效的控温,在普通的隔水式恒温培养
箱上可加装一个电子控温仪.若温度过高或过低,
则会延缓分裂周期,造成收获时细胞分裂相减少.
1.3气体环境
气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需
气体主要有0和既是细胞代谢产物,也
是细胞生长繁殖所需成分,他在细胞培养中的主要
作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜
pH为7.2～7.4,培养基的pH值也应调整到7.2～7.4
之间,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.
偏酸时细胞发育不良,偏碱时细胞会出现轻度固缩.
细胞培养液pH的调节最常用的为加NaHCO的方
法,因为NaHCO,可供CO,但CO易于逸出,故最
适用于封闭培养.
1.4培养液
植物凝集素(PHA)是体外淋巴细胞培养成败
的关键,只有在PHA的作用下才能进入有丝分裂,
因此要考虑他的质量和尝试,质量有问题药效会降
低,浓度过高可能会导致红细胞凝集,都会造成实
验效果差.
2操作步骤
2.1细胞接种
接种就是将注射器中的血液注入到培养瓶中.
将注射器针头刺人培养瓶的胶塞向培养液中加入
0.4mL～0.5mL血液.细胞接种通常是在无菌室超净
工作台内的酒精灯火焰区进行.接种时无菌操作是
否规范,直接影响到细胞培养的成败.如接种时如
不慎将手接触到培养瓶的瓶塞,或接触了注射器的
针头,可能会造成细菌中霉菌的污染.接种时,加
入血液量的多少也会对培养结果有影响,血液太少,
细胞稀薄,细胞生长速度减慢;血液太多,会造成
培养时细胞生长时营养成分不够,影响细胞生存.
接种操作是在酒精灯附近进行,接种时还应注意避
免血液遇高温被破坏.操作时手与酒精灯的距离以
火焰不烫手为宜,离火焰太近,血细胞可能被破坏,
甚至被烧焦成块,肉眼可见呈团块;同时也会造成
针头堵塞.出现这种情况,应及时更换针头.如已
接种,应更换一瓶培养液.
2.2秋水仙素
适量的秋水仙素,适当的处理时机和时间,是获
得足够数量的,良好细胞分裂相的条件.分裂相的多
少和染色体形态及带型处理是否良好均受其影响.
秋水仙素是一种生物碱,干扰细胞中微管组装,
抵制细胞纺缍体的形成,能使细胞分裂停止于分裂中
期,以积累大量的中期细胞.其浓度范围较宽,可相
差几十倍之多,常用质量浓度为8g/mL~0.5g/mL.
一
般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系,
如果在培养中,浓度过低或处理的时间过短,则标
本中的分裂细胞就少,染色体瘦长;用量过多,浓
度过高,虽能获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,
不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保
获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型
分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得足够多
的分裂相和长度收缩适度的染色体.另外,处理时
间延长,染色体发生分离,同样使染色体变粗短,
也不利于计数和分析.
加秋水仙素的时间是收集细胞制备染色体前
2h～3h,加入秋水仙素后,使秋水仙素的终质量浓
度为0.04g/mL~0.08g/mL培养液.实验前应根
据培养液的用量和秋水仙素的浓度计算出加入的剂
量.通常采用的加秋水仙素的器具是容量为1mL的
注射器,使用时也应注意控制好注射器活塞,避免
推动时用力过猛,导致秋水仙素加入量过鱼豆腐
多.
2.3收获细胞和制片
收获细胞和制片包括收集细胞,低渗,固定,
滴片染色等几中国理论
个步骤,每一步操作失误都可能造成
最后实验的失败,使玻片上观察不到染色体.
2.3.1收集细胞
此步骤操作不当,容易造成细胞丢失.培养瓶
从恒温箱中取出时,大部分细胞都沉淀在瓶子的底
部,在将培养瓶中液体吸入到离心管之前,应用吸
管将细胞充分吹打均匀,再移人离心管中.离心之
后,吸弃上清,也应小心操作,有时由于吸得过猛,
将与上清液相接处的淋巴细胞层吸掉了,造成大量
的分裂中期相细胞丢失.
2.3.2低渗
低渗处理是染色体制备中很重要的环节,是获
得分散良好的分裂相的关键步骤,低渗时间和低渗
温度都关系到制片的成功.低渗过度或不足都会造
成染色体形态不良.在低渗处理时期细胞十分娇嫩,
并且表面发黏,低渗细胞混匀时,吹打要适宜,避
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免细胞破碎及粘团,另外不要将细胞吸到吸管上部
及离心管上部,避免细胞丢失.通过对比实验认为
采用0.075mol,LKC137cI=处理20min一25min较合
适,效果较好.用0.075mol,LKC1溶液于处理中期
细胞,使细胞核膨胀破裂,染色体分散良好,便于
观察计数.当低渗处理时间过长时,细胞膜过早破
裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;如果低渗
处理时间不足时细胞膨胀不够,则染色体分散不好,
染色体仍然成团或相互重叠,不利于进行观察,计
数,分析.经过低渗处理的细胞因已卡通云朵图片
膨胀,容易过
早破裂,造成分裂细胞丢失,所以低渗后操作应特
别注意不要用力冲吸.
另外低渗还可使红细胞膜破裂,经离心后,血
影浮于上清液中被去除.
在观察制片结果时,如发现玻片上染色体有的
张不开,有的呈现团状,有的数目不够,这是由于
低渗时操作不当引起的.低渗不充分,染色体聚在
一
起;低渗过头,染色体丢失.低渗是否能达到目
的,操作时要注意两个方面:一是要使细胞充分与
低渗液接触.这就需要在加入低渗液后,要充分将
细胞吹打均匀;二是要注意低渗时的温度和时间.
2.3.3固定
固定技术也是制备良好分散的染色体的重要步
骤.低渗处理完后,需加入固定液,固定的目的是一战起止时间
对染色体形态进行固定.若染色体分散不良,可适
当加大冰乙酸含量,其同时有改善由于低渗处理不
够或固定不充分所造成的缺陷,但过量会造成染色
体形态变化和影响分带结果.染色体形态不良与加
固定液速度有关,加第一次固定液快或过快,可造
成飘带样染色体.
固定液每次使用必须新鲜配制,否则将会形成
酯类,从而影响固定效果.如果固定液不新鲜或甲
醇,冰醋酸的质量不佳时,染色体形象模糊,染色
体周围有胞浆背景,固定液为分析纯的甲醇和冰醋
酸按3:1的体积比配制.
预固定和固定时间:加固定液时,应沿管壁慢
慢加入并轻轻吹农村建房施工合同
打均匀,预固定和以后的二,三次
固定时,固定液加入太快,混匀太快,会使固定作
用过强,染色体扭转;固定作用若不足,染色体出
现毛刷状.固定液纯度要高,临时配制,固定后再
彻底打匀.吹打细胞时,用力要适度,如吹打过重,
会导致核型中染色体的丢失或变形.采用甲醇和冰
醋酸按3:1体积比的固定液进行固定,将常用的第
一
次固定时间5min,30min改为25min,20min,
适当延长时间,固定效果较理想.
2.3.4滴片
滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一
步.首先是载玻片要非常干净,否则会影响染色体
的分散和分带效果.滴片用的玻片应干净,无脂,
无酸才行.其次是滴片的距离,滴加量多少,制片
的方式都会影响染色体分散效果.
如果冰片冷冻不够,细胞难以贴附而造成丢失.
载玻片经过一系列处理擦干后,放置冰箱内,冰冻
4h以上,即为冰片.滴片时现用现拿出,否则会融
化,操作时采用0℃预冷的冰片滴片.
滴片时导致实验失败的原因有以下几方面:①
由于细胞悬液太稀,导致滴片时细胞稀少;②载玻
片上水太多,导致细胞悬液顺着水流失;③载玻片
不洁净,染色体分散不佳;④滴片后,应立即放入
7OcI=的烤箱中,以利于细胞的进一步胀开.
Giemsa染色液与pH的影响:染色液浓度高,
染色时间应缩短,如果染色液浓度增高,染色时间
又延长,染色体着色加深,形态结构不清,对裂隙,
染色体断裂的检出可能减少.pH偏碱,染色体着色
发蓝,色泽不艳,pH稍酸,染色体呈玫瑰色,色调
鲜艳,形态结构清晰,利于统计分析和畸变的检出.
烤片是染色体制备中最后一步技术.烤片的温
度,时间与染色体形态和分带有关.不宜温度过高
和烤片时间过长.
细胞培养和染色体制备实验从接种到制片长达
76h,在整个实验过程中必须严谨,不能有任何差
错.而且细胞所恶有甚于死者
培养实验不同于其他实验,步骤多,
整体性强,操作要求严格认真,最终实验才会取得
成功.
总之,随着医学的发展及人们对遗传疾病的逐
步认识,染色体制备技术现已是医学遗传学中最常
见而重要的一种技术.作为一名技术人员,做出一
张高质量的人体外周血淋巴细胞染色体标本是十分
重要的,这样才能更好地为临床诊断及优生与遗传
咨询工作服务.
参考文献
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