2023年4月18日发(作者：数字汉字大写)组织蛋白提取
组织蛋白提取
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下为组织蛋白六的词语
提取的全部内容。
组织蛋白提取
鼠脑组织总蛋白提取
一：蛋白提取
脑组织称重，按照1:8（1g脑组织加8ml)的比例计算蛋白酶抑制剂的量（Aprotinin 、
1.
Pepstatin、NaF、NaVO 、Leupeptin ，PMSF不稳定最后取出来加,都是1:100的稀释）和
34
TNE的量，先在每个EP管中加入计算好的TNE再加蛋白酶抑制剂，每个ＥＰ管中加入３颗珠
子,用匀浆器匀浆或用研磨棒研磨。
（蛋白酶抑制剂五种从-20拿到4度冰箱中溶解。各取100微升加
入10毫升的TNE中（13层析柜中)，TNE缓冲液（1.21g Tris，5.84g NaCl,0。37g EDTA/升)，
匀浆完毕后用枪头将混合好的溶液吸入EP管，一般大块组织加600微,小块加300微，
2.
4离心14000转/min,20min。
3。
取上清移入新EP管(最好离两次) ，溴酚蓝甘油SDS巯基乙醇等组成sample
buffer（4X)，Sample Buffer与蛋白比为3:1，在97度煮5分钟。防止盖子开，最好用东西
盖住。始终在冰盒中操作，最后蛋白放入—80。
二：测蛋白浓度
计算所需BCA的量，按MA：MB:MC=25：24：1的比例配好，每个孔总量为300ul,BSA：A-I各
加150ul，Mix加150ul
因BSA是溶解在NaCl,故加样时蛋白溶液和0.9％NaCl共加150ul（蛋白3ul,NaCl 147ul)
注意加样时要加复孔。
酶标仪震荡5s
37孵育2小时
Western Blot的有效检测下限为0。1—1ng
蛋白提取可以分为三个步骤:
第一步获取材料。
第二步分离目的细胞或组织成份并破碎。细胞破碎的方法分为开锁教程
机械法和非机械
法，机械法可以是使徒行者2谍影行动
树英语
振动、搅拌、研磨、压滤、超声、匀浆,非机械法可以是干燥、
改变渗透压、冻融、酶解（纤维素酶、溶菌菌、蜗牛酶)等，不同来源的材料对于
不同的处理方法耐受程度是不一样的,例如超声波可以很容易破碎动物细胞，但是
破碎酵母细胞就困难许多。
有三个问题需要指出：（1）所有的操作尽量在低温条件下进行，防止细胞内
的蛋白酶释放出来而将目的蛋白降解,最好全程都在冰浴中进行，有条件用液氮的
就用液氮，下同。(2）超声处理中会释放出大量的热，因此一定需要冰浴。同时超
声过程会释放自由基，有可能改变蛋白质的结构，可向系统中加入少量的GSH（谷
胱甘肽草率
)进行还原。另外，超声过程有可能打断蛋白质大分子，所以如果研究的蛋
白质分子量比较大时建议减少超声处理时间或者换用其它方法处理。（3)如果使用
蛋白酶处理,可能会将目的蛋白降解，同时还引入了新的蛋白质从而干扰实验，所
以一般不推荐使用。细胞的破碎与裂解过程没有严格的时间和空间界线,其作用仅
仅是为了使裂解过程更容易，因此在破碎细胞过程中所用的Buffer一般也是裂解
时的裂解液，注意不能加太多，根据经验，一般每克组织加2—3ml裂解液为宜。
组织蛋白提取
常用的蛋白酶抑制剂有以下几种:
丝氨酸蛋白酶抑制剂: PMSF，AEBSF-HCl，Aprotinin，Chymostatin，亮肽素
（Leupeptin）
天冬氨酸蛋白酶:PMSF，碘乙酸、抑肽素（Pepstatin），云芝发酵物
巯基蛋白酶抑制剂:PMSF，TLCK，TPCK，Antipain-HCl，N-乙基顺丁烯二酰亚胺
金属蛋白酶抑制剂（金属离子螯合剂）:EDTA，EGTA，塔罗肽
苏氨酸蛋白酶：目前缺乏资料
磷酸酶抑制剂：NaF，激活的原矾酸钠（激活方法将在试剂档案提及）、焦磷酸钠、-
甘油磷酸钠。
所有的去垢剂都由两部份组成，一部份是亲水的，一部份是疏水的，在助溶蛋白质的过
程中，去垢剂的疏水基团一般主要和蛋白质结合，亲水基的一端则倾向于溶解在水中。
溶于水后能解离成离子的去垢剂叫离子型去垢剂，否则叫非离子型去垢剂，离子型去垢
剂按照水中生成的离子类型又可以分为阳离子型去垢剂、阴离子去垢剂和两性离子去垢剂,近
年来还发明了含离子型亲水基又有非离子型亲水基的混合型去垢剂。在这五种类型的去垢剂
中，混合型垢剂垢一般不常用,而阳离子型去垢剂不可以用于SDS—PAGE(因为它们会使蛋白质
带上正电荷,电泳习性和SDS—PAGE原理相前背）。
用于蛋白质提取的去垢剂只有阴离子去垢剂、两性离子去垢剂和非离子型去垢剂，它们
的代表试剂如下：
阴离子去垢剂:SDS（十二烷基磺酸钠）、DOC（脱氧胆酸钠）、SLS（十二烷基肌氨酸
钠）
蓝牙鼠标突然没反应
两性离子去垢剂：CHAPS,Zwittergent系列
组织蛋白提取
非离子型去垢剂：Triton X-100，Triton X—114，Tween—20 ,NP40，C8APG（辛基葡
萄糖苷）
第三步就是进行裂解制样。
