抗体纯化

蛋白表达及抗体制备流程图

构建蛋白原核表

达载体（带HIS

orGST接头）

重组质粒转入蛋

白表达菌株BL21

orER2566

转化菌株的小量

诱导表达

转化菌株的大量

诱导表达

珠子吸附纯化上清洗涤包涵体

蛋白复性

抗体的制备

抗血清的检

测

具体实验步骤

（一）蛋白原核表达载体的构建

蛋白原核表达载体一般带有HisorGST接头。构建载体时要确保读码框

的正确。

（二）重组质粒转入蛋白表达菌株BL21orER2566

转化方法同常规转化。

（三）转化菌株的小量诱导表达

(1)从转化的平板中挑取单菌落，接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37℃

振荡培养过夜；

（2）取100l过夜培养的菌液接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振

荡培养50min左右，使OD

600

达到0.6-0.8；

(3)加入IPTG至0.5mM，37℃诱导培养4h；(注意设置不加IPTG的对照；过年风俗习惯 一

般诱导条件为37℃诱导培养4h，但根据蛋白的不同，诱导温度和时间会有

所不同)；

(4)取1mL菌液，12000rpm离心10min，收集菌体；

(5)用100L悲伤爱情故事 PBS悬浮菌体菌体，加入20L6SDS凝胶加样缓冲液，100℃

沸水浴10min；

(6)12000rpm离心10min，取菌体裂解液上清进行SDS-PAGE。

（if经诱导的菌株有目的蛋白表达，则继续如下操作）

（7）简笔画植物 以相同条件诱导并收集菌体（方法见1-4）；

（8）加入200LPBS悬浮菌体；

（9）将浑浊的菌体悬浮液超声至变清(注意冰上操作)；

（10）12000rpm离心10min，取上清至另一干净EP管，即为上清管

（11）余下沉淀用100LPBS悬浮，即为沉淀管（包涵体）；

（12）分别向上清管和沉淀管中加入6SDS凝胶加样缓冲液，100℃沸水浴10

min；

（13）12000rpm离心10min，取上清管和沉淀管的上清进行SDS-PAGE。

（if蛋白在上清或沉淀中有特异表达，则继续进行大量诱导表达）

（四）转化菌株的大量诱导表达

(1)挑取单菌落于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)按1：1000的比例转接扩大培养，37℃振荡培养至OD

600

达0.6-1.5左右（一

般250mLLB中加入5mL菌液，培养1h50min左右；最好摇500mL，以便有足

够的样品做后续实验）

(3)加入IPTG至0.5mM，37℃诱导4h（一般诱导条件同小量诱导；但根据蛋

白不同，有的诱导条件会有所不同。一般降低诱导温度，减少蛋白表达量可

能使蛋白在上清中表达；但大部分的蛋白是在包涵体中表达）；

（4）取1mL菌液，12000rmp离心10min；进行（三）（8）-（13）的操作；

（5）westernblot检测特异表达蛋白是否为目的蛋白；

（6）if蛋白在上清中特异表达，则用珠子吸附纯化上清（方法见试剂盒说明书）；

if蛋白在包涵体中特异表达，则洗涤包涵体（方法见步骤五）。

（五）包涵体的洗涤纯化

(1)8500rpm离心10min，收集沉淀；

(2)1000mL的菌液离得的沉淀用50mL的裂解液吹起，超声波破碎细胞；

(3)4℃，8000g，离心10min，包涵体沉淀以50mL2%的TritonX-100/Buffer

I重悬，37℃恒温振荡30min；

(4)4℃，8000g，离心10min，沉淀以50mL的BufferI重悬，超声波处理

5min/100mL悬浮液；

(5)4℃，8000g，离心10min，包涵体沉淀以50mL2%的TritonX-100/BufferI

重悬，37℃恒温振荡30min；

(6)4℃，8000g，离心10min，沉淀以50mL的BufferI重悬，37℃恒温振荡

30min。

(7)4℃，8000g，离心10min，沉淀以50mL的2mol/L尿素/BufferI溶解，

室温搅拌30min；

(8)4℃，8000g，离心10min，沉淀以50mL或25mL（根据蛋白量决定）的4mol/L

尿素/BufferI溶解，室温搅拌30min；

(9)4℃，8000g，离心10min，沉淀以50mL或25mL（根据蛋白量决定）的8mol/L

尿素/BufferI溶解，室温搅拌30min。

（注：保留各个步骤的上清或溶液进行SDS-PAGE；

溶解蛋白的尿素量不宜过多；蛋白浓度差异不大的条件下，优先选择低浓

度的尿素样品溶液作为免疫抗原。

整个过程在冰上进行）

（六）蛋白复性

透析复性法：

将适量的含目的蛋白的尿素溶液置于透析袋中，将透析袋放入装有20倍以

上蛋白样品体积的复性液PBS溶液的烧杯中，在预设环境温度（4℃，25℃和37℃

等）下，用磁力搅拌器中速地搅拌复性液，以加速溶液的渗透和扩散。每隔一定

时间（4℃约3-4h，25℃、37℃约2-3h）更换新的复性液，共4次。收集复性后

的样品，经4℃，12000g离心10min，上清即为目的蛋白的复性液。

（注：如果只需获得抗体，对蛋白纯度要求不高，则可以直接用蛋白的尿素样品

溶液作为免疫抗原；如果对蛋白纯度要求较高，则必须对蛋白进行复性才能作为

免疫抗原。）

（七）抗体的制备（改良方法）

(1)选用适龄的健康新西兰大白兔，从耳缘抽取0.5mL血液，提取血清作为空

白对照；

(2)用0.5-1mL约含500g蛋白质的融合蛋白溶液与相同体积的完全弗氏佐剂

充分混匀，分20个点对兔子进行皮下注射（如果蛋白浓度很高，可用PBS

稀释至0.5-1mL，（不）完全弗氏佐剂与蛋白溶液的体积比为1：1）；

(3)第3天，再次用0.5-1mL融合蛋白溶液与相同体积的完全弗氏佐剂充分混匀，

分20个点对兔子进行皮下注射；

(4)第28天加强免疫：用0.5-1四大美男子 mL融合蛋白溶液与相同体积的不完全弗氏佐剂

充分混匀，分15个点对兔子进行皮下注射；

(5)第35天采取颈动脉取血的方式获取足量血液，室温下静置2h，4℃静置过

夜，上清即为抗血清。

（八）抗体的检测

用Western-blot的方法对制备的抗体进行检测。将约1g抗原进行点样，

抗血清作为一抗在封闭剂中稀释200、500、1000、2000、5000倍。

SDS-聚丙烯胺凝胶电泳（SDS－纽贝斯特 PAGE）

（1）配胶

分离胶配方见表1，在烧杯里依次加入后，轻轻混匀，立刻倾倒入凝胶板中，

在室温下聚合30-60min，使之充分凝固（根据蛋白的大小选择分离胶的浓度，

分子量小的蛋白用高浓度胶，分子量大的蛋白用低浓度胶；一般厚胶的分离胶为

7.5mL左右，薄胶的分离胶为5mL左右）。

表1分离胶配方

胶的组分（10mL）10%（mL）12%（mL）15%（mL）

超纯水

30%丙烯酰胺溶液1.5mo基督教歌曲 l/LTris(pH8.8)

10%SDS

10%过硫酸铵

TEMED

4.0

3.3

2.5

0.1

0.10.004

3.3

4.0

2.5

0.1

0.10.004

2.3

5.0

2.5

0.1

0.10.004

（注：灌注好分离胶后，需立即加入2-3mL的异丙醇压胶，以使胶的界面平

整。加入基层胶之前需用水洗去玻璃板中的异丙醇。

积层胶配方(3mL)：在烧杯中依次加入2.1mL超纯水、0.5mL30%丙烯酰胺

溶液、0.38mL1.5mol/LTris(pH6.8)、0.03mL10%SDS、0.03mL10%过硫酸铵

和0.003mLTEMED，轻轻混匀，在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶,立即在积

层胶溶液中插入适当体积的点样孔梳子。在室温下聚合45min以上，使之充分凝

固（基层胶一般为2-3mL）。

（2）电泳槽中加入1XSDS电泳缓冲液,点样之前进行10-20min的预电泳。

（3）点样。薄胶可点样20-30L，厚胶可点样30-50L（westernblot时点

样量较平时可适量增多），proteinmarker点10L，prestainmarker点5L。

尽量使每个点样孔都有样品，空余的点样孔用10L6SDS凝胶加样缓冲液填

充。

（4）电泳。先用15-20mA的恒流电泳至基层胶和分离胶交界处；到达分离胶后

可增大电流至25-30mA电泳至样品跑至胶底部。

（5）染朝三暮四文言文 色。将电泳完的胶放入培养皿中，加伤感头像男动漫 入适量考马斯亮蓝染色液，于脱色

摇床中摇30-60min（根据染色液浓度的不同确定时间，时间不可过长）。

（6）脱色。吸去考马斯亮蓝染色液（可重复使用），用清水冲洗去胶上的浮色，

在清水中加入适量KCl和（或）冰醋酸于脱色摇床中摇至脱色，注意隔一定时间

换水；或者用微波炉的中火加热脱色，注意火力不能太大，每次加热时间不能太

长，多加热几次，多加点水，防止水沸腾使胶爆裂。

蛋白质印迹(Westernblot)

(1)将含有目标蛋白的样品首先进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；

(2)通过电转移的方法(恒压100v,4℃电转70min)将蛋白质转印至PVDF膜或硝

酸纤维素膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检

测；（转膜前注意挤走海绵中的气泡，放入转膜槽中动作要迅速，防止海绵

产生气泡；PVDF膜在使用前需用甲醇浸泡；膜必须保持湿润，不能离

开水环境；注意转膜的方向：负极放胶，正极放膜；滤纸不能太大，最好同

膜和胶的大小一样）。

(3)将转印好的膜用含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液作为封闭剂封闭30-60min；

(4)膜浸没在加入按比例用封闭剂稀释一抗的封闭剂中，于脱色摇床中摇1h以

上让稀释的抗体与膜结合（注意赶去封闭袋中的气泡；可将敷有一抗的膜于

4℃保存过夜，次日再摇1h以上，以使抗体与膜充分结合）。用加入1‰

Tween20的TBS（TTBS）缓冲液洗膜4次，每次10min；

(5)将相对应的二抗加入封闭剂（如果一抗为鼠单抗，则加入羊抗鼠二抗；如果

一抗为兔多抗，则加入羊抗兔二抗），使膜浸没其中于脱色摇床中摇1h。用

TTBS缓冲液洗膜4次；

(6)最后用DAB溶液显色。5-6mLPBS+30lH

2

O

2

（双氧水）+100lDAB.

(DAB有剧毒，注意戴手套操作；

染色后需立即用大量清水冲洗以终止反应，膜需立即吹干或吸干水分以免使

膜背景颜色加深）

蛋白相关试剂

一、SDS-PAGE试剂

PBS（磷酸缓冲液盐溶液）（pH7.4）：

137mmol/LNo型血和b型血 aCl

2.7mmol/LKCl

10mmol/LNa

2

HPO

4

2mmol/LKH

2

PO4

用800ml蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa

2

HPO

4

和0.24gKH

2

PO

4。

用HCl调节溶液pH值至7.4，加水至1L。

5XSDS电泳缓冲液1L配方：

Tris

6XSDSLoadingBuffer：

1MTris-Cl（pH6.8）3.75mL

甘油3mL

SDS1.2g

溴酚蓝0.02g

DTT0.93g

加蒸馏水定容到10mL-20℃保存

考马斯亮蓝染色液：

45mL蒸馏水

45mL乙醇

10mL冰乙酸

0.5%～1%考马斯亮蓝G250

甘氨酸

15.1g

72.0g5.0g

SDS

加蒸馏水定容至1L

SDS-PAGE电泳后1%考马斯亮蓝染色30分钟内即可脱色。0.5%可染色40分钟

二、Westernblot试剂

转膜缓冲液：

TBS洗膜缓冲液：

Tris12.1gNaCl

9g

Tris3.05g

甘氨酸14.4g

甲醇150mL重要，不要忘记加

加蒸馏水定容至1L4℃保存

加蒸馏水800ml后加入浓盐酸7.5mL至pH7～8

加蒸馏水定容至1L。

使用前加入Tween201mL至终浓度1‰(标记为TTBS)

封闭液：

5%脱脂奶粉溶于TBS中

30%丙烯酰胺；

三、包涵体洗涤试剂

裂解液：50mmol/LTris-HCl(pH7.2),

10mmol/LEDTA,

300mmol/LNaCl.

BufferI:20mmol/LTris-HCl(pH7.2),

5mmol/LEDTA,

100mmol/LNaCl.

29g丙烯酰胺

1g双丙烯酰胺

蒸馏水定容至100mL，用定性滤纸过滤后使用

2M/4M/8M尿素溶液:

分别称取一定量的尿素,用BufferI配置2mol/L、4mol/L、8mol/L的你尿素

溶液