多胺

材料与方法

1仪器和试剂

Waters1500系列,2487双波长紫外/可见检

测器,Breeze色谱工作软件。腐胺、亚精胺为Fluka

产品,精胺为Sigma产品,甲醇为色谱纯,水为超纯

水,其它试剂为国产分析纯。

2色谱条件

色谱柱:NovapakC18柱(Waters,1503.9

mm,4m)。流动相:甲醇∶水(60∶40,V/V),检测

波长为230nm,流速0.7mlmin-1,柱温30℃。

3材料处理

取植物材料1.0~2.0g,加入4ml预冷的5%

高氯酸(V/V)冰浴研磨,冰浴浸提1h后离心

(15000g,30min,4℃)。取500l上清液加入

10ml带盖塑料离心管中,加入7l苯甲酰氯,再

加入1ml2molL-1NaOH,涡漩20s后在37℃水

浴反应20min。加入2ml饱和NaCl溶液,混匀后

用2ml乙醚萃取,1500g离心5min后,取1ml

醚相真空干燥,用100l甲醇涡旋溶解后过0.45

m的滤膜,取10l进样。

4标准曲线制作

将3种多胺(Put、Spd和Spm)的标准品配成1

mmolL

-1

的贮液,各取40l按上述方法进行苯甲

酰化。分别取苯甲酰化后的多胺标准液0.03、0.

06、0.12、0.25、0.50、0.75、1.0nmol(10l)

-1

进

样,以面积对进样量作曲线,计算曲线方程和相关

性系数。

结果与讨论

1苯甲酰多胺的色谱行为

多胺在一般的反相柱上均能获得较好的分离。

由于多胺的次级胺基与柱子硅羟基的作用,不同的

柱子保留时间相差较大。我们选用ZorbaxODS

(Shimadzu)柱子时,Put、Spd与Spm的保留时间分

别为4.99、9.04和16.95min,与文献[7〗报道相

似。在同样的色谱条件下,选择相对“酸性”较弱的

NovapakC18(Waters)柱子上样,保留时间分别为

3.38、5.76与10.34min,一次样品的测定在12

min内可以完全分离(图1)。在选用64%的甲醇

作流动相时,可以在6min内实现样品的完全分

离,3种主要多胺仍有很好的分离度。

图1多胺标准品的高效液相色谱图

多胺与苯甲酰氯在碱性条件下的反应是将苯

甲酰基基团连在一级和二级胺基上,因而可以采用

紫外检测。而丹磺酰氯主要是与一级胺基基团反

应,由于植物体内的多胺结构差异主要体现在相差

一个或几个氨丙基或氨乙基上,这些次级胺基的存

在使得丹磺化产物与硅羟基产生了较强的结合,特

别是组织内多胺的种类较多时,需要梯度洗脱而且

长达45min的时间,流动相消耗较大,并需要荧光

检测器。

2苯甲酰化的反应条件

不同文献报道的温度及反应时间相差较大。

我们在摸索苯甲酰化反应的最佳条件中,发现

37℃为反应的最佳温度,中国新歌声第二季 时间以20~25min为好,

峰面积最大且副反应少。室温(30℃左右)反应

30~40min也可获得十分接近的结果。随着温度

的升高(<37℃),Put的反应更加完全,而Spd与

Spm的面积变化无显著差异。

苯甲酰氯的保留时间与Spd非常接近,且在用

乙醚萃取时也部分地会被萃取出来。在真空干燥

或氮气吹干时难以去除,可加入乙醚再次吹(抽)

干,直到没有明显的苯甲酰氯的气味外汇图表 为止。

3苯甲酰多胺的稳定性

设置了-70、-30、-18、0℃和常温5个温度,

发现苯甲酰多胺在避光贮存1周后,置-70℃下贮

存的,除Spd含量稍有变化外,Put与Spm的含量

无太大的变化。而在其他温度下3种多胺分解率

分别为69.0%、69.7%、69.9%,处理间没有明显

差异。在24h内的重复实验中,各温度处理间并

未发现明显的衍生物分解。多胺分解的另一原因

是光照,普通日光灯下3h就有明显的分解。因此

多胺在衍生化后应避光保存并在1d内完成测定

工作。

4波长选择

在220~280nm范围内每隔10nm进行波长

检测时,发现230nm塔菜怎么做好吃 有最大的响应(图2),3种多

胺最大吸收波长相近。由于230nm对苯甲酰氨

基的专一性吸收,受多胺脂肪链的影响不太大,因

此对多胺的检测较为灵敏。但230nm检测的同

时也增大了杂质及副反应的响应。文献[6,7]报道

多采用254nm作为检测波长。用254nm作为检

测波长时,杂质响应较小,3种主要多胺的峰突出,

但响应值较小,检测限高,样品取样量大。

图2标准样品的紫外光谱图

5线性范围与重现性

由于多胺在植物体内的含量一般较低,所以在

实验中尽可能选择较低浓度的多胺进样。结果表

597植物生理学通讯第38卷第6期,2002年12月明,Put、

Spd和Spm在0.1~1.0nmol范围内线性

关猪肚汤怎么做好吃 系良好,相关系数r分别为0.998、0.999、0.

999。Put、Spd与Spm的最低检测限分别为0.

0625、0.0625与0.03搞笑句子越短越好 13nmolL-1。3种多胺的检

测限接近荧光检测的方法[9]。实际上在我们的实

验中,即使灵敏度高至0.002(a.u.f.s)的时候,3

种多胺仍有较好的线性关系。

以标准多胺重复4次的实验结果显示,其相对

标准差(RSD)分别为3.4%、1.59%与3.78%。同

样的样品5次平行进样,求得的RSD分别为

0.4%、0.41%与0.65%。

6样品测定与回收率

取1.0g栽培大豆的种子干样按上述方法测

得Put、Spd和Spm含量分别为208.64、151.68和

42.82nmolg-1FW(n=3,图3为其典型色谱

图)分段法 。将多胺标准液加入样品多胺提取液中,计算

得到的回收率分别为92.1%、91.3%和103.2%

(表1)。

表1样品测定值与回收率(n=4)

样品号

样品量/nmolPutSpdSpm

加样量/nmol

PutSpdSpm

测定回收值/nmol

PutSpdSpm

平均回收率/%

PutSpdSpm

RSD/%PutSpdSpm

10.31510.21700.06090.500.500.500.46870.48320.4824

20.32010.23080.05820.500.500.500.47350.47180.565592.191.3103.22.732.493.20

30.30440.20760.06550.500.500.500.42040.43050.502440.33510.25700.06030.500.500.500.48010.44110.5271