NMDA受体

嘌呤受体P2X7激活谷氨酸受体NMDA

引起视网膜神经节细胞凋亡

【摘要】【目的】研究嘌呤受体P2X7

和谷氨酸受体NMDA激活诱导大鼠视网膜神

经节细胞凋亡的相互作用机制。【方法】①

对新生Long-Evan大鼠进行上丘注射荧光标

记物Aminostilbamidine标记RGC，NMDA受

体通道拮抗剂MK-801、APV和Memantine分

别与P2X7受体激动剂BzATP共培养，检测

它们对体外培养RGC存活率的影响；②未经

Aminostilbamidine标记的新生大鼠RGC，

以10mol/L钙离子荧光染料Fura-2标记

后，利用Ca2+影像测定仪分别测定BzATP及

三种NMDA拮抗剂对RGC胞内Ca2+浓度的影

响。【结果】三种NMDA拮抗剂均分别不

同程度阻断BzATP引起的RGC凋亡。BzATP

在50mol/L浓度下，约杀死的RGC，而

MK-801、APV和Memantine则均可明显减轻

BzATP对RGC的毒性作用，使RGC存活率分

别提高至、和。BzATP可引起RGC胞内Ca2+

持续升高，在50mol/L浓度下可使胞内

Ca2+升高至nmol/L。而MK-801、APV和

Memantine则均可显着降低BzATP介导的

Ca2+升高幅度，分别为、和。【结论】NMDA

受体拮抗剂可阻断嘌呤受体P2X7激活诱导

的RGC凋亡。P2X7受体和NMDA受体通道激

活可能共同介导着兴奋性神经毒作用且

P2X7在NMDA受体的上一环节先起作用。

【关键词】视网膜神经节细胞；P2X7受体；NMDA

Abstract:【Objective】TodemonstrateifP2X7receptorand

N-methyl-D-aspartate(NMDA)receptor

linktoinitiateretinalganglioncells

(RGC)death.【Methods】(1)Long-Evan

neonatalratswerebacklabeledwith

cellviabilitywasthenexaminedusing

P2X7receptoragonistBzATPandNMDA

receptorantagonistsMK-801,APVand

Memantine.(2)RGCweredissociatedfrom

theretinasofunlabeledneonatalratsandwereloadedwithFura-2,an

andthreeNMDAreceptorantagonistswere

appliedtoRGCtoexaminetheireffects田鸡怎么炒好吃

onintracellularCa2+levelsusingCa2+

imagingsystem.【Results】(1)BzATP(50

mol/L)couldkillabout(36%2%)of

athwaspreventedby

MK-801(10mol/L),APV(100mol/L)

andMemantine(100mol/L)witha

increasingthecellviabilityof(96%

4%)(P),(80%5%,P=)and(76%

9%,P=),respectively.(2)BzATP(50

mol/L)ledtoalarge,sustained

increasofintracellularCa2+(1183

109)nmol/minfluxtriggeredbyBzATPwasattenuatedbypre-and

co-inc馒头花样 ubationofMK-801(10mol/L),

APV(300mol/L)andMema中华美食街 ntine(30

mol/L)with(76%7%,P=),(51%

17%,P=)and(55%16%,P=),

respectively.【Conclusions】

StimulationofP2X7receptorleadsRGC

todeathmayupstreamactonNMDA

icatesthatbothP2X7

andNMDAreceptorareinexcitotoxicdeathofRGC.

青光眼高眼压最终导致视网膜神经节细胞

凋亡。兴奋性神经毒谷氨酸升高、N-甲基-D-

天冬氨酸受体激活是引起RGC凋亡的重要原

因［1］。前期研究已证实高眼压[2,3]可引

起嘌呤信号ATP释放，激活嘌呤受体P2X7

导致RGC细胞内钙离子浓度升高[4-7]、细

胞凋亡和RGC释放出谷氨酸。为进一步探讨

P2X7与NMDA受体在介导RGC凋亡机制中的

相互作用关系，本文进行了如下研究。

1材料与方法

RGC标记及RGC体外培养

购买怀孕Long-Evan大鼠饲养，取生后第

4～6天新生鼠，按本实验室成熟的技术，从

上丘注射荧光染料Aminostilbamidine，逆

行标记RGC。注射后2~8d内将动物给予过

量麻醉药处死幼鼠，摘取眼球，分离视网膜，

按RGC体外培养方法获得RGC细胞悬液，进

行24h培养。

RGC细胞存活率的测定

取5只来自不同母鼠的幼鼠进行P2X7与

NMDA受体相互作用的实验。将每个培养板内

的12个盖玻片分为3组，每组4孔：4孔为

对照组，不含任何药物；4孔含P2X7受体激

动剂BzATP；4孔先加入NMDA受体通道拮抗

剂MK-801或APV或Memantine，在37℃、

5%CO2的培养箱中培养30min，进行预处理，

然后加入BzATP。最佳浓度由预实验获得。

加药后培养板置于37℃、5%CO2的培养箱

中培养24h，然后将盖玻片取出，置于荧光

显微镜下，计数荧光标记的RGC。存活的RGC

细胞胞体发绿色荧光，胞浆内含发黄绿色强

荧光的不规则颗粒。在40高倍显微镜下计

数80个视野内存活的RGC。细胞计数由固定

的实验人员完成。计数时采用单盲法：计数

前由另一实验员将盖玻片进行随机编号，计

数人员对所计数玻片的处理不知情。

RGC胞内Ca2+浓度的测定

同前法培养RGC，但RGC事先不用荧光染料

标记。细胞内Ca2+浓度测定：细胞培养24h

后，加入10mol/L钙离子荧光标记物

Fura-2和200mg/Lpluoronic，室温下孵

育60min。将盖玻片取出置于Ca2+测定影

像仪上，进行单个RGC胞内Ca2+浓度的测定。

获取Ca2+影像时，盖玻片分别用340nm和

380nm光源激发，选定的视野内520nm的

发射光被系统捕获。Ca2+浓度由340nm和

380nm激发下测定的荧光强度的比率过年的作文400字左右 换算而

得。灌注液含105mmol/LNaCl,mmol/LKCl,

mmol/LNa-Hepes,mmol/LHepesacid,

mmol/LCaCl2,mmol/LMgCl2,5mmol/L

Gluco,75mmol/LMannitol。校正液含5

mol/Lionomycin和5mol/LEGTA。所有

实验均在室温下进行。被检测的RGC取自4

只来源于不同母鼠的幼鼠。

进行单独BzATP实验时，每次加入BzATP15

s，之间用灌注液冲洗6min，在同一细胞上

重复4次，获取可重复性的波峰；进行NMDA

拮抗剂阻断BzATP作用实验时，分别用三

种不同拮抗剂MK-801、APV和Memantine，

最佳浓度亦由预实验获得。加入BzATP15s

后，用灌注液冲洗3min，接着分别加入三

种不同拮抗剂3min。后再给予BzATP15s。

在同一细胞上实验重复2次，获取可重复性

的波峰。

数据处理

数据表达为平均值标准误。采用SPSS统

计软件进行数据处理和分析。应用独立样本

t检验检测组间差异。对于细胞活性实验研

究，实验次数表示每次数80个视野的载玻

片个数。因每次实验获取RGC浓度不同，每

次RGC计数结果先经标准化再列入统计学分

析：每个载玻片中RGC的百分比=100%。

对Ca2+影像测定,n为测定的细胞个数。

设定P为具有统计学差异。

2结果

NMDA受体拮抗剂阻断P2X7受体激动剂

BzATP介导的RGC胞内Ca2+升高作用

P2X7受体激动剂BzATP可引起RGC胞内

Ca2+显着升高[4,6]。本研究应用50

mol/LBzATP作用15s，RGC胞内Ca2+最

大可升高至nmol/L。移除BzATP后，用灌注

液冲洗6min，待胞内Ca2+浓度稳定后给予

第2次刺激，胞内Ca2+又升高，重复3～4

次得到可重复均一波峰，BzATP反应的平均

峰值为nmol/L。

NMDA受体拮抗剂可阻断BzATP介导的Ca2+

升高：分别用三种不同拮抗剂MK-801、APV

和Memantine进行实验。如先用BzATP15s

后，得到第一个RGC胞内Ca2+升高的波峰，

峰值为nmol/L，用灌注液冲洗3min，接着

MK-801预处理3min后，给予50mol/L

BzATP刺激15s，得到第２个RGC胞内Ca2+

升高的波峰，峰值为nmol/L。为了更客观地

观察MK-801的作用，在同一细胞再重复上

述实验，分别得到第３和第４个波峰，峰值

分别为nmol/L、nmol/L。将图1B中两次

MK-801作用下BzATP的反应高峰的平均值

nmol/L与两次单独BzATP刺激的反应高峰的

平均值nmol/L进行比较，MK-801可显着降

低BzATP介导的Ca2+升高幅度达。同法进

行APV和Memantine的实验，得到图1C和

1D，两者分别降低BzATP介导的Ca2+升高幅

度为、。三组数据均表明NMDA受体拮抗剂可

阻断BzATP介导的Ca2+升高。

NMDA受体拮抗剂减少P2X7受体激活

剂BzATP介导的RGC凋亡

对事先用荧光染料Aminostilbamidine标

记的幼鼠RGC进行原代培养。已知与50

mol/LBzATP共同孵育24h后，RGC数量

较正常对照组明显减少，呈剂量依赖性，且

细胞以凋亡形式死亡。本实验50mol/L

BzATP组RGC的数量为对照组的(64%2%)。

事先分别用NMDA受体通道拮抗剂MK-801、

APV和Memantine孵育30min，再与BzATP

共同孵育24h。MK-801和APV使BzATP诱

导的RGC凋亡数目大大减少,存活率上升，

但Memantine的作用较弱。

3讨论

嘌呤研究的进展

嘌呤和嘌呤受体是重要的调节递质影响着

中枢和周围神经系统功能［4］,近年来成

为神经科学领域研究的热点之一。

嘌呤家族分为P1、P2两大类。P1代表着以

腺苷及其A1、A2A、A2B和A3受体的一类核

苷；P2家族包括ATP及其核苷酸受体P2X1-7

和P2Y1-6，其中，P2X7受体是近年来发现

的、有独特特点的受体，在钙离子(Ca2+)内

流、细胞凋亡等方面起重要作用[5-10]。研

究表明哺乳类及鼠视网膜神经元含有

P2X1-7的受体表达，尤其RGC层有P2X7的

存在[11]。近年来研究发现P2X7受体的激

活参与了大量视网膜疾病的发生、发展

[12-14]。例如在玻璃体视网膜病变中，P2X7

受体的表达增加[12]；受体的激活可引起视

网膜周细胞收缩[14]。

我们已有的研究阐明了ATP受体P2X7激活

是导致RGC凋亡的重要环节[5-8]，提出青

光眼视神经损伤嘌呤调节的可能机制：青光

眼高眼压引起嘌呤信号ATP释放[2-3]，作

用于视网膜细胞上P2X7受体，引起Ca2+内

流导致RGC凋亡。将嘌呤调节引入青光眼中

研究，为探讨青光眼发病机制提供了新的思

路与途径。

NMDA与青光眼发病机制

青光眼是由病理性高眼压引起，以RGC死

亡、视功能逐渐丧失为主要特征的一种进行

性视神经病变。RGC以凋亡的形式死亡，但

目前RGC凋亡的机制尚未完全清楚。

有wps高级筛选 学说认为升高的眼内压可能降低了视神

经乳头的血流灌注，但在没有眼内压升高的

视网膜动脉阻塞的病例中，却没有见到在青

光眼中应见到的同样改变，表明在正常的血

管弹性下，单纯血管因素是不足以引起RGC

死亡的；另有人认为，升高的眼内压也可能

因为扩张了视神经乳头筛板从而抑制了神

经营养因子诸如脑源性BNDF等的轴浆运输，

但研究发现RGC的死亡可以先于神经营养因

子的缺乏，这表明RGC的死亡在早期可能胞

体早有变化，后因神经营养因子的缺乏而加

速了死亡进程。另一理论涉及的是兴奋性神

经毒损伤：兴奋性神经毒谷氨酸升高、NMDA

受体激活引起RGC细胞内Ca2+升高导致细胞

死亡[1]。尽管目前对此学说仍未完全肯定

[15，16]，但可重复性的研究证实谷氨酸受

体激动剂确实对RGC表现出毒性作用[1，17，

18]。临床和基础研究表明谷氨酸受体NMDA

拮抗剂Memantine能预防压力诱导的RGC死

亡，提示谷氨酸在青光眼发生发展中起一定

作用[19]。然而，升高的眼内压是如何产生

过量的谷氨酸去过激NMDA受体还不完全清

楚，最初有研究报道，降低谷氨酸转运子水

平并不能逆转这一作用[19，20]。

P2X7受体/NMDA受体在青光眼发病机制中

的作用

研究已表明，嘌呤信号转导在高眼压致谷

氨酸增高的过程中起重要中介调节作用。首

先高眼压可引起ATP释放。实验发现，压力、

损伤、应激等均可刺激嘌呤信号ATP的释放

[2，3,22，23]，如轻度的压力可导致内层

视网膜星状细胞释放出ATP[22],眼内压升

高可检测到视网膜持续的释放出ATP[2，3]。

我们将剪去眼前段的新鲜牛眼放入自制压

力容器中，牛眼杯内ATP浓度随压力升高而

增高。另外，在激光诱导的实验性猴青光眼

模型中检测到玻璃体腔ATP水平的增高。最

近在临床高眼压青光眼病人房水中也证实

有ATP释放。

ATP受体P2X7激活可导致RGC凋亡[1-3，

5-8]。关键的研究显示P2X7受体激活可诱

发出视网膜星状细胞[25]和RGC释放出谷氨

酸。因此，眼内压力、P2X7受体、谷氨酸释

放及NMDA受体之间可能存在一定的相互作

用，而明确其相互作用机制可能是理解RGC

死亡和保护的关键部分。

本研究结果显示，三种NMDA受体拮抗剂

MK-801、APV和Memantine均可阻断P2X7受

体激动剂BzATP介导的RGC胞内Ca2+升高作

用和减少体外培养的BzATP介导的RGC死亡

数量。有力地说明，P2X7与NMDA受体之间

可能共同介导着RGC兴奋性神经毒损伤机制，

且P2X7在NMDA受体的上一环节先起作用。

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