高效液相色谱Ο荧光法测定辣椒素
和二氢辣椒素3
徐爱平1) 王富华1) 王晓容2) 李乃坚1) 赖穗春1)
(1)农业部蔬菜品质监督检验测试中心，广州510640;
2)
广东省农业科学院果树研究所，广州510640)
摘要 建立了一种测定辣椒素和二氢辣椒素的反相高效液相色谱荧光法。样品中的辣椒素和二氢辣椒素用乙腈提取，以水和甲醇为流动相梯度洗脱,HP ODS Hypersil (5μm ,250mm ×4mm i.d )柱分离，用荧光检测器(λex =229nm ,λem =320nm )测定。研究表明辣椒素和二氢辣椒在0.02～125.00μg/mL 范围内，峰面积与待测物的质量浓度呈良好的线性关系，相关系数均为0.9999，相对标准偏差在0.44%和2.74%之间，回收率为
80.8%～99.9%。该方法操作简便、快速，适用范围广，重现性好，灵敏度高。
关键词 辣椒素；二氢辣椒素；高效液相色谱中图法分类号 TS 207.3
收稿日期:200Ο05Ο31；修回日期:2005Ο11Ο01
3广东省重大科技专项(2003A20504)和国家农业行标准(2005Ο58)资助
食物链的定义徐爱平，男,1972年生，助理研究员.工作单位：农业部蔬菜品质监督检验测试中心，广州510640
辣椒中的辣味成分最早由Thres (1876)从辣椒果实中分离出来，并命名为辣椒素(Cap saicin )。此后又有一些辣椒素同系物从辣椒果实中被发现，它们被统称为辣椒素类物质，其中辣椒素和二氢辣椒素占90%以上，其它同系物只占少数[1]。
辣椒素类物质可增强食欲，改善消化功能，具有抗菌、抗肿瘤和镇痛作用，广泛地应用于食品和医药行业[2]。由于辣椒素是评价辣椒品质的指标之一,
生活中不同的群体对辣椒素类物质的适用范围不同，因此测定其含量很有必要。目前辣椒素的检测主要采用紫外比色法[3]，测定结果的准确性和灵敏度较差。用液相色法定性定量测定辣椒素的研究较少，国外相关的研究主要集中在辣椒干物质中辣椒素的检测上[4]，国内未见液相色谱-荧光法测定辣椒素和二氢辣椒素的报道。
笔者根据含水情况，将样品分为2大类，研究了
辣椒素和二氢辣椒素的高效液相色谱检验方法。该方法采用乙腈直接提取后H PL C (FLD )测定，简便、快速，各项技术指标均能满足检测要求。1 材料与方法
1.1 仪器及试剂
高效液相色谱仪Agilent1100，带荧光检测器(FLD )；植物粉碎机：上海悦丰仪器仪表有限公司;
电热恒温水浴锅：上海仪表集团供销公司。辣椒素和二氢辣椒素标准物质购自Fluka 公司(纯度99.5)，用甲醇配成100μg/mL 的标准储备液，再根
据需要稀释成相应含量的标准工作液；乙腈和甲醇
(色谱纯)；超纯水。
1.2 色谱条件
色谱柱:HP ODS Hypersil (5μm ,250mm ×
4mm i.d )；流动相:A 为甲醇,B 为水；洗脱梯度为:50%A ,50%B (0min );80%A ,20%B (15min ，保持至20min );50%A ,50%B (23min ，保持至28min )；流速:0.40mL/min ；检测器为荧光
检测器，荧光检测波长λex =229nm ,λem =320nm 。1.3 样品处理
干样(含水量<10%)处理：以四分法取可食部
分250.0g ，置58℃烘箱中烘烤10～12h ，取出冷却
称量，用植物粉碎机粉碎，过孔径1mm 筛，混匀样品存于棕色瓶中备用。含水样品(含水量>10%)处
理：以四分法取可食部分300g 左右，切碎混匀后称取150g ，加蒸馏水150mL ，用组织捣碎机捣碎，存于聚乙烯瓶中备用。含水量在5%～15%时采用任
一方法进行处理均可。
第24卷第6期2005年 12月华 中 农 业 大 学 学 报
襄汾中学
Journal of Huazhong Agricultural University Vol.24 No.6Dec.2005,592～595
提取：称处理干样2.00g 或湿样5.00g 于250mL 带聚乙烯内盖的玻璃瓶中，加乙腈50mL ，湿样
干煸菜花的家常做法
中加氯化钠3g ，然后盖紧盖,80℃水浴4～5h ，每20min 振摇1次，每次30s 左右，对含水样品振摇时间可延长至1min 。静置提取液，取上清液过0.45μm 滤膜，滤液待分析。
对辣椒素含量较低的样品可浓缩上清液，然后定容、过膜，按本文中“1.2”的方法测定。
2 结果与分析
2.1 流动相的选择
辣椒素和二氢辣椒素属同系物，弱极性，用有机溶剂如甲醇和乙腈洗脱出峰早但很难分离，而用超纯水和其它极性溶剂进行洗脱则不易被洗脱出来，使用甲醇和水，采用合适的梯度洗脱，辣椒素和二氢辣椒素在HP ODS Hypersil 柱上分离效果好，分离
度为2.5，出峰时间分别为11.070min 和13.179min ，条件优化后的色谱图见图1。2.2 检测波长的选择
据文献[4,5]，辣椒素和二氢辣椒素的常用激发波长分别为288nm ,229nm ,280nm 和275nm ，对
应的发射波长分别为325nm ,320nm ,338nm 和330nm 。
采用这4对波长对微量的辣椒素和二氢辣椒素进行测定，发现当荧光检测器选择激发波长229nm 和发射波长320nm 时，辣椒素和二氢辣椒素的灵敏度最高(图2)，最低检出限(s/n =3)分别达到0.10mg/kg 和0.05mg/kg ，峰形较好，干扰少。2.3 线性范围和检测限
辣椒素和二氢辣椒素的质量浓度在0.02～125.00μg/mL 之间，样品浓度与峰面积呈正相关,
线性关系方程和检测限及相关系数见表1
。
图1 辣椒素和二氢辣椒素的标准样品色谱图
Fig.1 Chromatogram of standard of cap saicin and dihydrocap
saicin
图2 样品中辣椒素和二氢辣椒素的色谱图
Fig.2 Chromatogram of sample of cap saicin and dihydrocap saicin
3头孢硫脒
95 第6期徐爱平等：高效液相色谱Ο荧光法测定辣椒素和二氢辣椒素
表1 辣椒素和二氢辣椒素的线性范围、回归方程和检测限
T able1 Linear ranges,regression equ ations,and detection limits for the determination of capsaicin and dihydrocapsaicin
检测对象Analyte
回归方程1)
Regression equation
线性范围(mg/kg)
Linear range
相关系数
r
检测限(mg/kg)
Detection limit(s/n=3)
辣椒素Capsaicin C=0.0128A+0.0170.020～1250.99990.10 二氢辣椒素Dihydrocapsaicin C=0.0072A+0.0920.010～1250.99990.05 1)C：检测对象的浓度Mass concentration of analyte;A：峰面积Peak area
2.4 回收率和精密度
按以上方法，选用辣椒粉Y003和鲜辣椒W017 2个样品，进行2个水平添加回收试验，每个添加水平取3个平行样，方法的回收率与精密度数据见表2。结果表明辣椒素和二氢辣椒素的回收率为80.8%～99.9%，相对标准偏差为0.44%～2.74%。2.5 辣椒素提取的充分性
辣椒素主要存在于辣椒中，为了更好地反应辣椒素类物质的提取情况，采用第2次提取法，即对提取辣椒素后的干样残渣和湿样下层进行再次测定，测得辣椒素和二氢辣椒素的含量为第1次测定结果的0.34%～2.78%(表3)。结果表明经第1次处理，辣椒素和二氢辣椒素的提取是充分的。
表2 辣椒素和二氢辣椒素的回收率测定结果(n=3)
T able2 R esults of recovery experiments of capsaicin and dihydrocapsaicin(n=3)
样品Sample 检测对象
Analyte
车子年检
添加水平
Level
原有含量(mg/kg)
Original
添加含量(mg/kg)
Added
测定值(mg/kg)
Found
回收率/%
Recovery
RSD/%
辣椒粉Y003Capsaicin 1
2
409.6
409.6
50.0
500.0
44.5
489.0
89.0
97.8
1.49
1.16
Dihydrocapsaicin 1
2
141.1
141.1
50.0
500.0
45.1
风格的英文499.3
90.1
99.9
2.74
0.48
鲜辣椒W017Capsaicin 1
2
41.7
41.7
4.0
40.0
3.2
38.1壮士发冲冠
80.8
95.3
1.85
0.44
Dihydrocapsaicin 1
2
49.3
49.3
4.0
40.0
3.0
38.4
90.8
95.9
0.48
1.00
表3 辣椒素和二氢辣椒素提取的充分性
T able3 Full abstraction for the determination of capsaicin and dihydrocapsaicin
样品Sample
特性
Character
辣椒素Capsaicin
Found1
C1(mg/kg)
Found2
C2(mg/kg)
C2/C1
(%)
东华理工大学分数线
二氢辣椒素Dihydrocapsaicin
Found1
C1(mg/kg)
Found2
C2(mg/kg)
C2/C1
(%)
辣椒粉Y003干Dry490.6 2.000.40141.10.480.34辣椒干Y025干Dry309.5 1.080.35184.6 1.000.54鲜辣椒W017湿Wet41.68 1.20 2.7849.270.81 1.64辣椒酱W021湿Wet36.180.64 1.7836.570.280.76
3 结 论
本试验通过乙腈提取，采用水和甲醇为流动相梯度洗脱,HP ODS Hypersil柱(5μm,250×4mm i.d)分离和荧光检测器λex=229nm,λem=320nm 测定，建立了辣椒素和二氢辣椒素的分析方法，其检出限为0.10mg/kg和0.05mg/kg，且在0.02～125.00μg/mL范围内线性关系良好，线性相关系数为0.9999，回收率为80.8%～99.9%，相对标准偏差为0.44%～2.74%。
本试验的测定结果表明，该检测方法操作简便、快速，重复性好，灵敏度高，可以用于食品和医药中辣椒素和二氢辣椒素的分析。
495 华中农业大学学报第24卷
参 考 文 献
1 Constant H L ,Cordell G A.Nonvamide ,a constiluent of capsicum
oleorsin.J Nat pord ,1996,(59):425～426
2 狄 云，蒋健箴，石正强.辣椒素类物质的代谢生理研究现状.中
国蔬菜,2000,(3):48～59
3 狄 云，蒋健箴，石正强.辣椒果实中的辣椒素类物质研究进展.
食品科学,1999,(6):30～32
4 Collins M D.Improved met hod for quantifying capsaicinoids in
capsicum using HPLC.Hort science J ,1995,30(1):137～1395 俞 蔚，雍克岚.辣椒素的荧光特征研究.食品科学,2003,(24):
30～32
Determination of C apsaicin and Dihydrocapsaicin by High
Performance Liquid Chromatography(HPLC)
Xu Aiping 1)
Wang Fuhua 1)
Wang Xiaoro ng 2)
Li Naijian 1)
Lai Suichun 1
)
(1)S u pervision an d Testi ng Cent re f or V eget able Qualit y ,M i nist ry of A g ricult ure ,
Guangz hou 510640,Chi na;
2)
Pomol g y Rearch I nstit ute of Guang dong A ca dem y of A g ricult ural S ciences ,
Guangz hou 510640,Chi na )
Abstract A met hod for t he determination of cap saicin and dihydrocapaicin has been established .C
ap saicin and dihydrocapaicin were detected by reverd 2p ha high performance liquid chromatograp hy
wit h FLD detection (λex =229nm ,λem =320nm )after ext racted wit h acetonit rile.Chromatograp hic
paration was carried out on a HP ODS Hypersil column (5μm ,250mm ×4mm i.d )wit h a mo bile p ha consisting of met hanol and water.A good linear relationship between peak area and concent ration of cap saicin and dihydrocapaicin existed in t he range of 0.02～125.00μg/mL wit h r =0.9999.The re 2covery was in t he range of 80.8%～99.9%wit h relative standard deviation of 0.44%～2.74%(n =3).The met hod is simple ,nsitive and rapid.It could by applied to t he determination of cap saicin and di 2hydrocap saisin.
K ey w ords cap saicin ;dihydrocap saicin ;high performance liquid chromatograp hy
(责任编辑：陈红叶)
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95 第6期徐爱平等：高效液相色谱Ο荧光法测定辣椒素和二氢辣椒素
