甲醛降解细菌的分离鉴定和降解效果测定
杨 郁1 金志华1 李宁慧1 金飞玲1 巨蟹座特点黄翔和２
(1浙江大学宁波理工学院生物与化学工程分院，宁波 315100
2浙江省诸暨市教育局，诸暨 311800)
摘要：从某化工厂污水处理系统的活性污泥中分离纯化得到一株能降解甲醛的革兰氏阳性菌，对其进行形态及生理生化特性测定，并提取并纯化其基因组DNA，通过PCR扩增菌株的16SrDNA，测序结果表明该菌株和苏云金芽孢杆菌的同源性为100%。在含1.2μL/mL的甲醛的培养基上培养该菌36h后，甲醛降解去除率达到72％以上。
关键词： 甲醛；分离鉴定；16S rDNA；PCR
中图分类号： 文献标识码： 文章编号：
Isolation，Identification and Degradation effect of a formaldehyde-degrading bacteria
YANG Yu1, JIN Zhi-hua1, LI Ning-hui1, JIN Fei-ling1, HUANG Xiang-he2
(1 Biotechnology and Chemical Engineering Department of Ningbo Institute of Technology Zhejiang University, Ningbo 315100；2 Department of Education of Zhuji Zhejiang )
Abstract: A Gram positive bacteria strain that degrades formaldehyde was isolated from activated sludge of wastewater treatment plant from a chemical corporation.. The strain was obrved through structure and physiological and biochemical characteristics. Molecule identification methods including distilled DNA, PCR amplification, Production Sequence showed that it was similar to Bacillus and 16SrDNA quence shared 100% homology with that of Bacillus thuringiensis. Formaldehyde (1.2μL/mL) was degraded above 72% with 36 h by this strain.
Key words: Formaldehyde；Isolation and Identification；16S rDNA；PCR
甲醛（HCHO）又名蚁醛，具有强烈的致癌和促癌作用。大量文献记载，甲醛对人体健康
的影响主要表现在嗅觉异常、刺激、过敏、肺功能异常、肝功能异常和免疫功能异常等方面。被世界卫生组织确定为致癌和致畸形物质。
孕妇能吃洋姜吗目前，治理甲醛污染的方法主要有化学反应方法、物理吸附技术、臭氧负离子技术、纳米光催化技术、低温等离子技术、植物净化和生物降解等方法。但化学反应法大量反复使用会造成新的二次污染；物理吸附法需要动力，能耗大；臭氧氧化法对无机物无效，有副产物，臭氧浓度太高时对人体有害；纳米光催化法效率较低、性能不稳定；低温等离子法耗电量大而且作用时间较短，需要不定期进行处理；植物净化法摆放过多，夜间使房内的二氧化碳浓度过高，影响健康。生物法降解甲醛具有降解效果好、投资费用低、占地面积小、工艺流程简单、无二次污染等优点而迅速成为国内外研究的热点。
本文所研究的是从活性污泥中分离得到一株能降解甲醛的微生物，检定其作为降解甲醛应用菌的可能性，并对其进行生理生化特性鉴定及基因组的测序，确定其分类学位置，以期在工业生产中有所应用。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
（1）试剂及试剂盒
草酸铵结晶紫染液、卢氏碘液、番红复染液、孔雀绿染液、番红染液、1％结晶紫染液、20%硫酸铜水溶液、硝酸银鞭毛染色液、甲基红试剂、吲哚试剂、PCR产物纯化试剂盒
（2）16S rDNA 基因的扩增用试剂：10×buffer (including Mg2+)、dNTP、PCR引物（正向引物Pf : 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物Pr : 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′）、MgCl2、Taq Plus DNA Polymera
（3）培养基和溶液
Ⅰ、 LB培养基：胰化蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母提取物50g、H2O 1000mL、pH7.0
Ⅱ、MS培养基：MgSO4 0.1g CaCl2.2H2O 0.02g KH2PO4 0.68g MnSO4.H2O 0.001 g K2HPO4 1.73g FeSO4.7H2O 0.03g NH4NO4 1.0g，H2O 1000mL。
Ⅲ、DNA提取所用溶液：20％SDS溶液、TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl；1mmol/LEDTA，pH8.0）、5mol/L NaClO4、氯仿－异戊醇（V/V 24：1）
Ⅳ、琼脂糖凝胶电泳（溴酚蓝蔗糖溶液染色）
1.2 实验方法
1.2.1 菌株分离纯化
Ⅰ、取活性污泥悬浮液10ml于LB培养基中，在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h后，吸取10ml富集液于装有100ml MS培养基的250ml三角摇瓶中，并加入80μL质量浓度为37%～40国庆调休％甲醛），最后将三角摇瓶用锡纸包住瓶口（以防甲醛挥发）；在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h。
Ⅱ、取菌悬液，稀释涂布于LB平板上，30℃恒温培养24h。在平板上挑选出各单菌落菌种，接种于加有240μL甲醛溶液的什么护肤品好MS大灰兔培养基中，在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h。分别取样，测定其溶液中的甲醛浓度，选出甲醛浓度最低的摇瓶，用棉签接种于LB斜面上，30℃恒温培养24h，分离出菌株。
1.2.2 菌株鉴定
（1）对分离出的菌株进行一系列形态特征及生理生化特征鉴定。
（2）进行DNA提取，16S rDNA 序列的扩增（PCR反应条件为：95 ℃ 4min ；95 ℃ 1min ，48 ℃1min ，72 ℃ 1min ，30 个循环；72 ℃ 10min），琼脂糖凝胶电泳及PCR产物纯化、测序，确立同源性。
1.2.3 降解甲醛效果测定
菌体接入到装有100mL MS培养基的三角瓶中，在30℃，150r/min的摇床上培养12h后，转接到装有200ml MS培养基的三角瓶中，并加入240μL甲醛，最后将三角瓶瓶口用锡箔纸密封；在30℃，150r/min的摇床上培养8h后，每隔2h取一次样。从三角瓶中取1mL菌液于1.5mL的离心管中；将离心管放在12000r/min的高速离心机中离心10min；取出后，取上清夜5μL于比色管中，加5mL水将其稀释1000倍，并加入1mL的显色剂；最后放入58℃的水浴锅中显色30min。 显色完全后在413nm波长下测甲醛浓度（OD），并绘制出降解曲线图。
2财务证书． 结果与分析
2.1 菌株分离纯化结果
参照1.2.1所示的实验方法，得到一株降解甲醛效果较好的菌株，命名为9号菌。菌落形态见图1所示：
图1. 9号菌的菌落形态
2.2 菌株形态特征及生理生化特征的鉴定
对9号菌株进行了一系列形态及生理生化特征的测定，结果见表1：
菌的生理生化特征基本符合《伯杰细菌鉴定手册》中芽孢杆菌属的特征。所以初步判断9号菌为芽孢杆菌属的菌。
表1. 菌株形态及生理生化特性测定
菌体形态特征 | 生理生化特征 |
墨守成规的反义词革兰氏染色 | 阳性 | 接触酶 | 阳性 |
芽孢染色 | 有内生孢子 |
鞭毛染色 | 周生鞭毛 | 吲哚试验 | 阴性 |
荚膜染色 | 无荚膜 |
菌体大小 | 3×0.8～4×0.9μm | 甲基红试验 | 阳性 |
孢子位置 | 中生 |
孢子囊 | 不膨胀 | 糖发酵试验 | 利用葡萄糖 产酸不产气 |
孢子大小 | 2×0.8μm |
| | V.P. 反应 | 阳性 |
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2.3 DNA测序结果
2.3.1 DNA的提取纯化
取提取的7个DNA样品电泳，结果见图2。从图中可以看出4号条带最亮，其次为3，2，7，8，5。因此取2、3、4、6、7、8号管中的 DNA溶液作为模板进行PCR扩增。
2号 3号 4号 5号 6号 7号 8号
图2.DNA样品电泳图
2.3.2 PCR扩增
71 81 22 44 83 82 46 43 41 marker
图3. PCR扩增结果
图3中最右边一条为marker 标记，从下到上第一条最亮的为1Kb标记，从图中可以看出在1500bp处有条带出现，说明扩增后的16S rDNA长度约为1500bp。
2.3.3 PCR产物纯化结果
经PCR产物纯化试剂盒纯化后的PCR产物，取2μL，到200μL 到ddH2O中，测定其浓度。纯化后的PCR产物共100μL，其浓度为100 ng/μL。具体结果见表2：
表2.PCR产物纯化结果
OD230 | OD260 | OD280 | OD320 | OD260/OD280 | OD260/OD230 | 稀释后浓度 ng/μl |
0.014 | 0.020 | 0.013 | 姚明自传 0.0 | 1.55 | 1.35 | 1.0 |
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2.3.4 16SrDNA测序
